Die Untersuchung von Prozessen auf genetischer und Proteinebene ist in der Pflanzenforschung von entscheidender Bedeutung. Unser Ansatz ermöglicht die Inspektion von sezernierten Labyrinthproteinen mit höchster räumlicher zeitlicher Auflösung an verschiedenen Infektionsseiten und Geweben. Die Trojanische Pferd-Methode untersucht nützliche automatisierte Sekretoretheienfunktionen.
Es umgeht zeitaufwändige und herausfordernde Labyrinth-Transformationen und ermöglicht detaillierte Studien zu sezernierten Proteinen im Labyrinth appelplatz. Detaillierte Informationen über die richtige Infektion von hinzugefügten Labyrinthblättern, Quasten und Ohr. Und zeigt die erfolgreiche Untersuchung der Infektionsprogression und Proteinfunktion im Zielgewebe.
Demonstriert wird das Prozedere von Isabell Fiedler, einer Grad-Studentin aus dem Labor. Um das Experiment zu beginnen, kratzen Sie Eumadous von einer Pediatrplatte mit einer sterilen Pasteurpipette. Impfen Sie 5 Milliliter YEPS Light Medium mit Eumadous.
Wachsen Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius, mit ständigem Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute für 16 Stunden. Am nächsten Tag 900 Mikroliter frisches YEPS-Licht mit 100 Mikrolitern der Übernachtungskultur mischen. Messen Sie den OD-600 mit YEPS Light Medium als Leerzeichen in der Spektralphotometeranalyse.
Verdünnen Sie die Nachtkultur mit frischem YEPS Light Medium auf eine OD-600 von 2. Lassen Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius mit ständigem Schütteln bei 200 Rpm wachsen, bis sie die mittlere Log-Wachstumsphase erreicht, die durch eine OD-600 von 8 bis 1,0 angezeigt wird. Nach der Inkubation ernten Sie die Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang 3000 Mal chi.
Entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes waschen Sie die Zelle Pilette einmal mit 1 Kulturvolumen von DDH2O. Drehen Sie die Zellen bei 3000 Zeit Chi für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Dann setzen Sie die Zellpilette vorsichtig in DDH2O, mit einer 20 Milliliter Glaspipette. Hierdurch wird das endgültige OD-600 TO 3.0 für einen Trojanischen Pferdetest oder 1,0 für die Krankheitsbewertung angepasst. Kultivieren Sie die Labyrinthpflanzen zu einem Stadium von erwachsenen Blättern, wo mindestens Blatt 7 innerhalb des Stiels wächst.
Als nächstes übertragen Sie die Eumadous-Kultur in eine 3-Milliliter-Spritze mit einer 20 Gauge bi one hypodermischen Nadel. Drücken Sie den Stiel sorgfältig, um das Spiegelstammgewebe zu lokalisieren. Die Basis des Spiegelstammes kann durch einen Übergang vom härteren Stiel zum weicheren Gewebe unterschieden werden.
Markieren Sie den Spiegelstamm mit einem Stift auf dem Stiel. Injizieren Sie 1,5 Milliliter eumadische Kultur 1 Zentimeter über dem Shoot Mirror Stem oder Florescence Mirror Stem. Sobald die Labyrinthpflanzen die Quastestufe erreicht haben, drücken Sie den Stiel vorsichtig, um die Quaste im Stiel zu lokalisieren.
Markieren Sie die Spitze und die Basis der Quaste auf dem Stiel mit einem Stift. Übertragen Sie die eumadische Kultur in eine 3-Milliliter-Spritze mit einer 20 Gauge bi one hypodermischen Nadel, um insgesamt 1,5 Milliliter des Inokulums um die Quaste zu injizieren. Um die gleichmäßige Verteilung des Inokulums zu sichern, legen Sie langsam 5 Milliliter an der Spitze, der Mitte und der Basis der Quaste, die mit dem Stift markiert ist.
Übertragen Sie die eumadische Kultur in eine 3-Milliliter-Spritze mit 20 Gauge bi eine hypodermische Nadel. Injizieren Sie die Impfnadel so tief wie möglich in den Raum zwischen den Schalenblättern, ohne das Ohr zu verletzen, und geben Sie dann 1,5 Milliliter des Inokulums um das Ohr frei. Als nächstes entfernen Sie die Spritze und Nadel und massieren Sie vorsichtig den Cob, um die Eumadous-Lösung gleichmäßig zu verteilen.
10 Mikroliter Inokulum auf eine PD-Holzkohle-Schneckenplatte fallen lassen. Dann bei Raumtemperatur für 2 Tage inkubieren. Hyphae Sekretion ZM Mach1 sind von fluoreszierenden und Kirschsignal umgeben.
Im Gegensatz dazu zeigen nicht geheime Hyphen nur fluoreszierendes Signal im Pilzzytoplasma. Unsachgemäße Quastenlokalisierung oder ungleiche Verteilung des Inokulums kann zu einer nicht infizierten Quaste oder nur zu einer teilweisen Infektion der Quaste im Vergleich zur gleichmäßigen Verteilung führen. Der solo pathogene Trojanische Pferd ProgenesterStamm SG-200, kultiviert auf PD-Holzkohleschnecke, bildet weiße Flaumfilamente auf der Platte, wie gezeigt.
Während der Eumadous-Stamm FB1 eine Paarung vor der infektiösen Filamentbildung erfordert. Nach der Infektion, die mögliche Reaktion von Anzeichen das Trojanisches Pferd Leberprotein kann mit verschiedenen Methoden einschließlich Krankheitsbewertungen oder mikroskopische Bildgebung analysiert werden. Bei vielen Krankheitserregern sind Transformation und Sekretion gut verstanden und können auf ähnliche Weise erforscht werden.
Daher ermöglichen sie die Untersuchung des Wirts, die nicht anfällig für Transformation sind.
