遺伝的およびタンパク質レベルに関するプロセスを調査することは、作物研究において非常に重要です。我々のアプローチは異なった伝染の側面およびティッシュで最も高い空間時間分解能の分泌された迷路蛋白質の点検を可能にする。トロイの木馬法は有用なオトマトスの分泌能力を探る。
それは時間がかかり、挑戦的な迷路の変換を回避し、迷路のアペルプラッツ内の分泌タンパク質に関する詳細な研究を容易にします。追加された迷路の葉、タッセルや耳の適切な感染に関する詳細情報。そして、標的組織における感染の進行とタンパク質機能の成功した研究を示す。
手順を実証するのは、研究室の卒業生であるイザベル・フィドラーです。実験を開始するには、滅菌パスツールピペットを使用してペディエータープレートからユーマドゥーを引っ掻きます。ユーマドゥーでYEPSライトミディアムを5ミリリットル接種する。
200 rpmで16時間一定の揺れをとり、28°Cで培養を成長させます。翌日は、新鮮なYEPSライト900マイクロリットルと100マイクロリットルの一晩培養液を混合します。分光光度計分析で、YEPSライトメディアをブランクとしてOD-600を測定します。
新鮮なYEPSライトミディアムで一晩培養して、2のOD-600に希釈します。培養は、8~1.0のOD-600で示される、中間対数成長期に達するまで、200rpmで一定の揺れで28°Cで成長させます。インキュベーション後、細胞を3000回のchiで10分間回転させて収穫する。
上清を捨てます。次に、セルピレットを1回DDH2Oの培養体積で1回洗浄する。3000タイムチーで細胞を10分間回転させ、上清を捨てます。
次いで、20ミリリットルのガラスピペットを用いて、DDH2Oで細胞ピレットを慎重に再懸濁する。トロイの木馬アッセイの最終的なOD-600 TO 3.0を調整し、疾患評価のために1.0を調整する。少なくとも葉7が茎の中に成長する成体の葉の段階に迷路植物を栽培します。
次に、ユーマドゥー文化を20ゲージbi 1皮下注射針で3ミリリットルの注射器に移す。茎を慎重に押して、ミラーステム組織を局所化します。ミラーステムの基部は、より硬い茎からより柔らかい組織への移行によって区別することができる。
ペンを使用して、茎のミラーステムをマークします。シュートミラーステムまたは花序ミラーステムの上に1センチメートルのユーマズ培養液1.5ミリリットルを注入します。迷路の植物がタッセルステージに到達したら、茎を慎重に押して茎のタッセルを局所化します。
ペンを使用して、ステムの先端とタッセルのベースをマークします。ユーマドゥー文化を20ゲージのビ1皮下注射針で3ミリリットルの注射器に移し、タッセルの周りに合計1.5ミリリットルの接種液を注入する。接種物の等分布を保証するために、ペンでマークされた先端、真ん中、およびタッセルのベースに5ミリリットルをゆっくりと置きます。
ユーマドゥー文化を20ゲージビ1皮下注射針で3ミリリットルシリンジに移す。耳を傷つけずに、できるだけ深く殻の葉の間の空間に接種針を注入し、耳の周りに接種物の1.5ミリリットルを放出する。次に、注射器と針を取り出し、慎重にコブをマッサージしてユーマドゥー溶液を均等に分配します。
PD炭オーガープレートに10マイクロリットルの接種液を滴下します。その後、室温で2日間インキュベートします。ZMマッハ1を分泌するハイファエは、蛍光と桜の信号に囲まれています。
対照的に、非分泌性ヒphphaeは真菌細胞質において蛍光シグナルのみを示す。不適切なタッセルの局在またはinoculumの不等分分布は、非感染したタッセルまたは偶数分布と比較して、タッセルの部分的な感染をもたらす可能性があります。単独病原性トロイの木馬プロジェネ生成株SG-200は、PD炭オーガー上で培養され、図示されるようにプレート上に白い綿毛フィラメントを形成する。
ユーマドゥー株FB1は感染性フィラメント形成前に交配を必要とする。感染後、トロイの木馬の肝臓タンパク質の兆候の可能性のある応答は、疾患評価または顕微鏡イメージングを含む様々な方法を使用して分析することができる。多くの病原体にとって、形質転換と分泌はよく理解されており、同様の方法で探索することができる。
したがって、これらは、変換の影響を受けにくいホストの研究を可能にします。
