Investigar processos sobre níveis genéticos e proteicos é crucial na pesquisa de culturas. Nossa abordagem permite a inspeção de proteínas de labirinto secretadas com maior resolução temporal espacial em diferentes lados e tecidos de infecção. O Método Cavalo de Tróia explora recursos automatizados úteis.
Contorna as transformações de labirintos demoradas e desafiadoras, e facilita estudos detalhados sobre proteínas secretas dentro do labirinto appelplatz. Informações detalhadas sobre a infecção adequada de folhas de labirinto adicionadas, tassels e ouvido. E mostra o estudo bem sucedido da progressão da infecção e da função proteica no tecido alvo.
Demonstrando o procedimento será Isabell Fiedler, estudante de pós-graduação do laboratório. Para começar o experimento, arranhe Eumadous de uma placa de pediatr usando uma pipeta pasteur estéril. Inoculado 5 mililitros de YEPS Light Medium com Eumadous.
Cresça a cultura a 28 graus Celsius, com agitação constante a 200 rpm por 16 horas. No dia seguinte misture 900 microliters de yeps light frescos com 100 microliters da cultura da noite para o dia. Meça o OD-600 usando o YEPS Light Medium como um branco na análise do espectrofotômetro.
Diluir a cultura da noite para o dia com o fresco YEPS Light Medium para um OD-600 de 2. Deixe a cultura crescer a 28 graus Celsius com agitação constante a 200 rpm, até chegar à fase de crescimento do tronco médio, indicada por um OD-600 de 8 a 1,0. Após a incubação, colde as células girando-as a 3000 vezes chi por 10 minutos.
Descarte o supernaspeso. Em seguida, lave a pilette celular uma vez com 1 volume de cultura de DDH2O. Gire as células a 3000 vezes chi por 10 minutos e descarte o supernasce.
Em seguida, suspenda cuidadosamente a pilette celular em DDH2O, usando uma pipeta de vidro de 20 mililitros. Ajustando assim o OD-600 TO 3.0 final para um ensaio do Cavalo de Tróia ou 1.0 para classificação de doença. Cultive as plantas do labirinto para um estágio de folhas adultas, onde pelo menos a folha 7 cresce dentro do talo.
Em seguida, transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com uma agulha hipodérmica calibre 20 bi um. Pressione o talo cuidadosamente para localizar o tecido da haste do espelho. A base do Tronco Do Espelho pode ser distinguida por uma transição de talo mais duro para tecido mais macio.
Marque o tronco do espelho no talo usando uma caneta. Injete 1,5 mililitros de cultura eurómade 1 centímetro acima do Haste do Espelho de Shoot ou da Haste do Espelho de Inflorescência. Uma vez que as plantas do labirinto cheguem ao estágio tassel, pressione o talo cuidadosamente para localizar o tassel na haste.
Marque a ponta e a base do tassel na haste usando uma caneta. Transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com uma agulha hipodérmica calibre 20 bi um para injetar um total de 1,5 mililitros do inóculo ao redor da tassel. Para assegurar a distribuição igualitária do inóculo, coloque lentamente 5 mililitros na ponta, no meio e na base do tassel marcado com a caneta.
Transfira a cultura eumadous para uma seringa de 3 mililitros com 20 bitolas bi uma agulha hipodérmica. Injete a agulha de inoculação no espaço entre as folhas da casca o mais profundamente possível sem ferir a orelha e, em seguida, solte 1,5 mililitros do inóculo ao redor da orelha. Em seguida, remova a seringa e a agulha e massageie cuidadosamente a espiga para distribuir a solução eurómes igualmente.
Solte 10 microliters de inóculo em uma placa de carvão pd. Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 2 dias. Hyphae secretando ZM Mach1 são cercados por sinal fluorescente e cereja.
Em contraste, a hifa não inclinada só mostra sinal fluorescente no citoplasma fúngico. A localização inadequada de tassel ou a distribuição desigual do inóculo podem resultar em tassel não infectado ou apenas infecção parcial do tassel em comparação com a distribuição uniforme. A cepa solo patogênica do Cavalo de Tróia Progenester SG-200, cultivada em carvão PD auger, forma filamentos brancos de fluff na placa, como mostrado.
Enquanto a cepa eumadous FB1 requer acasalamento antes da formação de filamentos infecciosos. Após a infecção, a possível resposta de sinais da proteína hepática do Cavalo de Tróia pode ser analisada usando vários métodos, incluindo classificações de doenças ou imagens microscópicas. Para muitos patógenos, a transformação e a secreção são bem compreendidas e podem ser exploradas de forma semelhante.
Assim, permitem o estudo do hospedeiro, que não são suscetíveis à transformação.
