El método es relativamente simple y permite la edición eficiente de genes de células B de macaco rhesus. El método permite la prueba de células B editadas genéticamente con fines terapéuticos en macacos rhesus. También es adecuado para la investigación preclínica de terapia de células B.
El método general puede adaptarse para otros tipos de células. Si el procedimiento se sigue correctamente, uno no debe esperar luchas. Sin embargo, como la eficiencia de corte de ARNg y un lote de buena calidad de plantilla recombinante que proporciona AAV6 son críticos.
Para comenzar, precaliente los medios de cultivo de células B en un baño de agua de 37 grados centígrados. Descongele los estimulantes de células B en hielo. Prepare un tubo del tamaño adecuado que contenga un medio de descongelación precalentado.
Descongele uno o dos viales de esplenocitos de macaco rhesus primario o PBMC en un baño de agua de 37 grados centígrados. Decantar los esplenocitos en el tubo preparado que contiene un medio de descongelación precalentado. Enjuague los criotubos para recoger todas las células.
Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 10 mililitros de medio de descongelación para el lavado. Repita las centrifugaciones tres veces para eliminar el medio de congelación.
Después de la última centrifugación, resuspender las células a un estimado de cinco veces 10 a seis células por mililitro en un medio de cultivo de células B. Combine 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de azul de tripano al 0,4% y cuente las células en un hemocitómetro. Ajustar la concentración celular a tres veces 10 a seis células por mililitro con medio de cultivo de células B de acuerdo con el recuento de células.
Luego, agregue los estimulantes de células B a sus concentraciones finales y mezcle. Transfiera las células a una placa de cultivo celular e incubarlas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Después de asentarse, las células deben formar una monocapa densa y pequeños grupos de células pueden ser ya visibles.
Después de aproximadamente dos días, las células deben estar sanas, irregulares y haber formado grupos visiblemente más grandes. Después de activar las células B, prepare los reactivos para la electroporación y la transducción. Precaliente el tampón dúplex libre de nucleasa DMSO, el tampón T y el tampón E o E2 del kit de electroporación a temperatura ambiente.
Descongele la plantilla de reparación dirigida por homología rAAV6, o HDRT, y los estimulantes de células B en hielo. Resuspender el ARN de guía única CRISPR Cas9, o sgRNA, a 100 micromolares en tampón dúplex. Reconstituir durante 10 minutos a temperatura ambiente y mezclar mediante vórtice y movimiento.
Coloque el sgRNA reconstituido en hielo hasta su uso. Para la electroporación de 10 microlitros, prepare 550 microlitros de medio de cultivo de células B con estimulantes y DMSO al 1%. Agregue 50 microlitros de este medio con o sin antibióticos en una placa de cultivo celular de 48 pocillos.
Luego, agregue rAAV6 HDRT al medio en los pozos, hasta el 20% del volumen del pozo. Precaliente el plato preparado y el medio restante en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. A continuación, para la electroporación de 10 microlitros, prepare 1,15 microlitros de ribonucleoproteína, o RNP, mezclando 0,4 microlitros de Cas9 61 micromolares con 0,75 microlitros de ARNg de 100 micromolares en tampón dúplex.
Incubar el RNP durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de mezclarlo con las células. Después de la incubación, se pueden combinar múltiples RNP si se va a dirigir simultáneamente más de un locus. A continuación, prepare las células para la electroporación.
Deje las celdas a temperatura ambiente para evitar choques de temperatura. Después de la incubación, cosecha las células en un recipiente apropiado. Enjuague el plato con DPBS para recoger el número máximo de células.
Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en DPBS aproximadamente dos veces 10 a seis células por mililitro, según el número de células puestas en el cultivo. Combine volúmenes iguales de suspensión celular y azul de tripano al 0,4% y cuente con un hemocitómetro.
Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, resuspender las células en tampón T precalentado a 5,55 veces 10 a siete células por mililitro, según el recuento de células. Configure el sistema de transfección encendiendo la máquina y ajustándola a 1, 350 voltios, 15 milisegundos y un pulso. Coloque la estación de pipetas dentro de la campana de flujo laminar.
Para cada serie de 10 electroporaciones, prepare un tubo de transfección con tres mililitros de tampón E. Inserte el tubo en la estación de pipetas. Combinar 1,15 microlitros de RNP con nueve microlitros de células por electroporación. Preparar al menos un 20% más para evitar burbujas e incubar a temperatura ambiente durante un minuto antes de la electroporación.
Aspirar 10 microlitros de RNP y mezcla celular en la punta de electroporación en una pipeta de electroporación. Inserte la pipeta cargada en la estación de pipetas e inicie la electroporación. Asegúrese de que las puntas estén completamente libres de burbujas de aire para evitar la formación de arcos.
Expulse inmediatamente las células electroporadas en el pequeño volumen de medio precalentado preparado, con o sin rAAV6, dentro del pocillo 48. Añadir muestras de control sin transfección a los pocillos de cultivo. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante cuatro a seis horas.
Al final de la incubación, agregue 450 microlitros de medio de cultivo de células B precalentado que contenga estimulantes, DMSO y con o sin antibióticos en la placa. Realizar análisis de ADN genómico después de 24 horas. Cuantifique la eficiencia de edición con la reacción en cadena de la polimerasa de gotas digitales, o PCR, utilizando un cebador fuera del brazo de homología y un cebador dentro del inserto.
Realice PCR para amplificar el sitio de inserción y secuenciación de Sanger para verificar la edición correcta. Para analizar los niveles de proteína, cultive las células durante 40 a 48 horas después de la electroporación para permitir cambios en la expresión de proteínas y realice un análisis por citometría de flujo. La producción de rAAV6 utilizando un ayudante adenoviral autosilenciante habilitado para tetraciclina resultó en la producción de cuatro veces 10 a 10 GC por mililitro de medio de cultivo celular, superando la producción utilizando una transfección triple sin ayuda de 30 a 40 veces.
La purificación opcional resultó en la eliminación de la mayoría de las células T CD3 + y las células mieloides CD14 + y CD16 +, con purezas de 80 a 95% de células CD20 + B que se obtienen de forma rutinaria. La edición genética de las células B primarias del macaco rhesus se muestra aquí. Este estudio mantuvo una alta viabilidad celular, al tiempo que eliminó la expresión de la cadena ligera en células B al 80%.
La mayoría de las células B todavía expresaban isotipo IgM. La adición de rAAV6 que codifica el anticuerpo 1485 HDRT dio como resultado la edición de genes y la expresión de la superficie del anticuerpo 1485 en 16 a 21% de las células B, aunque a una intensidad de fluorescencia más baja para las cadenas de anticuerpos que en las células B no editadas. La adición de 1% DMSO e incubaciones concentradas extendidas con el HDRT rAAV6 generalmente aumentaron la eficiencia de edición.
Usando este método, generalmente se logró una eficiencia de edición del cinco al 20% y hasta el 40%, dependiendo del macaco rhesus individual y la calidad del lote rAAV6 HDRT. Mientras realiza la electroporación, asegúrese de tener suficiente mezcla para la transfección y que no haya burbujas en la punta. Las células se pueden analizar por cualquier método deseado o se puede realizar una transferencia autóloga al macaco rhesus donante.
