El protocolo de ensayo de citotoxicidad utilizando líneas celulares de pez cebra puede responder preguntas sobre la toxicidad aguda de los productos químicos en los peces o ayudar a definir las concentraciones de prueba apropiadas para otros ensayos alternativos de peces. La principal ventaja de este ensayo en placa de 96 pocillos es la combinación de diferentes criterios de valoración de viabilidad para determinar la citotoxicidad de las células de pez cebra, que es una especie de pez importante en los estudios de ecotoxicidad. El protocolo es muy simple.
Si sigue todos los pasos descritos correctamente, uno no debería encontrar ningún problema. Este protocolo ayuda a lograr estudios de ecotoxicidad de origen animal que evalúen los efectos en líneas celulares de peces derivadas de diferentes órganos o etapas de la vida, como los hepatocitos en células embrionarias. Para comenzar a colocar las células ZEM2S o ZFL, calcule el volumen de las respectivas suspensiones celulares necesarias para obtener el número deseado de células para los ensayos.
Llene un depósito de reactivo estéril con el medio de cultivo completo para la línea celular correspondiente y transfiera el volumen calculado de la suspensión celular al reservorio para un volumen total de 20 mililitros. Con una pipeta multicanal, mezcle suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo sin formar espuma ni burbujas. Luego, usando la micropipeta multicanal, agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa transparente de poliestireno de 96 pocillos para obtener un recuento de células viable de 60, 000 células por pocillo para las células ZEM2S y 40, 000 células por pocillo para las células ZFL.
Incubar la placa a 28 grados centígrados durante 24 horas. Para exponer cualquier tipo de células a diferentes concentraciones de las sustancias químicas de ensayo, preparar la concentración deseada de soluciones de la sustancia de ensayo en los medios de cultivo para la línea celular de interés sin suero fetal bovino o FBS. Después de la incubación de 24 horas, deseche cuidadosamente los medios gastados de los pocillos utilizando una micropipeta multicanal.
Luego agregue 100 microlitros de una solución química de prueba particular por pocillo en triplicados técnicos, lo que significa tres pocillos para cada concentración química de prueba. Coloque los grupos de control en la misma placa que los productos químicos de ensayo en triplicados técnicos. Para el control en blanco, agregue 100 microlitros del medio de exposición en tres pocillos libres de células.
Para el control negativo, agregue 100 microlitros del medio de exposición a tres pocillos que contengan células. Para el control positivo, exponga tres pocillos que contienen células a una solución Triton X-100 al 1% preparada en el medio de exposición. Selle las placas con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo e incube las placas a 28 grados centígrados durante 24 horas.
Después de 24 horas de la exposición química de prueba, deseche cuidadosamente los medios de exposición de los pocillos vertiendo el contenido en una bandeja de recolección y lave cada pocillo con 200 microlitros de PBS. Luego, para eliminar el PBS sin perder células, viértalo con cuidado en una bandeja de recolección. Para realizar los ensayos Alamar Blue o AB y CFDA-AM, agregue 100 microlitros de la solución respectiva por pocillo e incube la placa durante 30 minutos en la oscuridad a 28 grados centígrados.
A continuación, mida la fluorescencia en un lector de placas de fluorescencia en las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas mencionadas en el texto. Para realizar el ensayo rojo neutro o NR, tome la solución de trabajo NR que tiene una concentración de 40 microgramos por mililitro y centrifugar a 600 G durante 10 minutos. A continuación, retire cuidadosamente las soluciones AB y CFDA-AM previamente agregadas de los pozos vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.
Con una micropipeta multicanal, agregue 100 microlitros de la solución de trabajo NR por pocillo e incube la placa a 28 grados centígrados durante tres horas. Una vez finalizada la incubación, vierta cuidadosamente la solución NR de la placa en una bandeja de recolección y lave los pocillos agregando 150 microlitros de PBS por pozo. Después del lavado, agregue 150 microlitros de la solución de extracción NR por pocillo e incube la placa agitándola suavemente en un agitador de placas durante 10 minutos antes de medir la absorbancia a 540 nanómetros con un lector de placas.
Para llevar a cabo el ensayo MTT, después de la exposición química de prueba de 24 horas, retire cuidadosamente los medios de exposición vertiendo el contenido en una bandeja de recolección y, utilizando una micropipeta multicanal, agregue 100 microlitros de solución de trabajo MTT por pocillo en la oscuridad. Incubar la placa a 28 grados centígrados durante cuatro horas en la oscuridad. Luego deseche la solución MTT vertiendo el contenido en una bandeja de recolección y agregue 100 microlitros de DMSO en cada pocillo para extraer los cristales de formazan.
Incubar la placa en un agitador de placas durante 10 minutos antes de medir la absorción a 517 nanómetros utilizando un lector de placas. Para el ensayo AP, los pocillos correspondientes a concentraciones en blanco, de control positivo y altamente citotóxicas de sustancias químicas de prueba mostraron color azul y baja fluorescencia, lo que indica la ausencia o una reducción de células viables. En contraste, los pocillos correspondientes a bajas concentraciones citotóxicas de prueba química y control negativo que contienen un alto número de células viables convirtieron la resazurina en resorufina rosada con mayor fluorescencia.
Para el ensayo NR, las concentraciones altamente citotóxicas de los productos químicos de prueba y el control positivo son transparentes o de color rosa pálido con baja absorbancia, mientras que los pocillos que contienen células viables que retienen el colorante NR muestran un color rosa oscuro y una alta absorbancia. Del mismo modo, para el ensayo MTT, los pocillos sin células viables son transparentes, mientras que los que contienen células viables transforman MTT en formazán de color violeta. Sobre la base de los porcentajes de viabilidad celular calculados, se estimó la mitad de la concentración máxima del inhibidor o el valor de IC50 para los diferentes productos químicos de prueba en líneas celulares ZFL y ZEM2S.
No se observaron diferencias significativas en la viabilidad celular para cultivos con y sin FBS, lo que indica la idoneidad de los medios de cultivo privados de FBS para el período de exposición química de 24 horas. Los ensayos MTT y NR no mostraron un efecto significativo de las concentraciones variables de DMSO de 0.1% a 1% en la viabilidad celular, lo que indica que estas líneas celulares apoyan el uso de DMSO como solvente hasta un 1%Preste especial atención al manipular células chapadas para evitar el autodesprendimiento durante todo el procedimiento y prepare cuidadosamente la solución de trabajo roja neutra para evitar cualquier precipitación de colorante. Este procedimiento se puede aplicar a estudios que abordan varios aspectos de los efectos químicos en peces utilizando modelos in vitro, y contribuir al progreso de los estudios de ecotoxicidad sin animales.
