El aislamiento de células madre sigue siendo un desafío importante debido al coaislado de las células progenitoras utilizando métodos actuales. Desarrollamos un nuevo ensayo libre de biomarcadores para aislar las células madre en reposo de los progenitores mixtos. La principal ventaja de este ensayo basado en esferoides, retención de etiquetas, puede expandir y aislar las células madre vivas de sus progenitores hija por FACS utilizando el etiquetado CFSE o Far Red.
Mientras que las terapias convencionales erradican la mayoría de las células cancerosas de próstata, las células madre cancerosas permanecen debido a la resistencia terapéutica, impulsando así la progresión de la enfermedad. El aislamiento celular similar a un tallo permitirá la identificación de genes novedosos que pueden ser co-dirigidos terapéuticamente para la remisión efectiva de la enfermedad. Nuestro ensayo de retención de etiquetas es aplicable para el aislamiento normal de células madre de varios tejidos y células, y para la investigación de células madre cancerosas.
Es importante destacar que este ensayo es aplicable a otros cánceres de células epiteliales, como los cánceres de mama y colorrectales. Comience por recubrir platos de cultivo de 100 milímetros con dos mililitros de solución de fibronectina de 2,5 microgramos e incubarlos durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, aspirar la solución y dejar que los platos de cultivo se sequen al aire en el gabinete de bioseguridad durante 45 minutos.
Agregue nueve mililitros del medio de crecimiento de células epiteliales de próstata a un plato recubierto de fibronectina y manténgalo caliente en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Descongelar un vial de células epiteliales de próstata humanas congeladas en un baño de agua de 37 grados Celsius, y resuspender las células en 10 mililitros de medio caliente. Centrifugar la suspensión celular a 500 g durante cinco minutos.
A continuación, aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo caliente y transferir un mililitro de la suspensión directamente al plato recubierto de fibronectina con el medio precalegado. Luego incubar el plato en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.
Si co-etiqueta las celdas, prepare las celdas etiquetadas con BrdU en una referencia 2D de 10 días como se describe en el manuscrito del texto. Luego agregue cinco micromolares CFSE o Far Red e incubar las células durante 30 minutos. Después de la incubación, aspira cuidadosamente el medio con el tinte y lavar las células dos veces con cinco mililitros de PBS caliente.
A continuación, realice la digestión enzimática con 05%trypsin EDTA de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Las células se resuspendieron en matriz de membrana de sótano, uno a uno, fría y mezcla media de cultivo para la formación de prostasfera 3D.
Para preparar el cultivo de la prostasfera en un sistema de matriz de sótano 3D, descongele la matriz de membrana del sótano a cuatro grados centígrados durante la noche y manténgala en hielo antes de usarla. A continuación, agregue suavemente un mililitro de matriz de membrana sótano helada en un volumen igual de medio de cultivo helado. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
Resuspender cinco veces 10 a 1/4 células epiteliales de próstata humana en matriz de membrana sótano frío en hielo y mezcla de medios de cultivo para un volumen total de 500 microlitros. Pipetear la solución al borde inferior de cada pozo y girar la placa para distribuir uniformemente la mezcla. Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique.
A continuación, cúbralo con un mililitro de medio de cultivo caliente por pozo, asegurándose de no molestar el anillo. Para cosechar las prostasferas etiquetadas por CFSE, sustituya el medio por dos mililitros dispase y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar varias veces. Incubar la placa a 37 grados celsius durante 30 minutos para digerir la matriz, luego recoger la mezcla de la esfera en un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Centrifugar las esferas a 500 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 500 microlitros de EDTA caliente 05%trypsin, y transferirlos a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Incubar las esferas a 37 grados Celsius durante cinco minutos, luego añadir 500 microlitros de PBS caliente con 10%FBS.
Pasarlos a través de una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 26 para disociar completamente las esferas. Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos. A continuación, aspirar y desechar el sobrenadante.
Resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo cálido con un microgramo por yoduro propidium mililitro para manchar las células muertas e incubarlas durante un minuto a temperatura ambiente. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego lave las células con un mililitro de medio caliente.
Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo caliente y recoger las células en tubos inferiores redondos de poliestireno de cinco mililitros filtrándolas a través de tapas de presión de colador de células de tamaño de poro de 35 micras. Realice análisis FACS de células prostráesferas dispersas por CFSE dispersas por trippsina.
Usando celdas no etiquetadas como control negativo y celdas etiquetadas con CFSE como un control positivo para establecer las puertas, ejecute la muestra para ordenar y recoger las subpoblaciones de celdas fraccionadas CFSE-alta y CFSE-baja. Las células epiteliales de próstata humanas normales primarias se colocaron en platos de cultivo recubiertos de fibronectina y el crecimiento celular se mantuvo en el cultivo 2D. Tras la transferencia a un cultivo 3D con una matriz de membrana sótano, las células epiteliales diferenciadas se extinguieron lentamente y sólo quedaron las células madre de la próstata.
El etiquetado doble de las células epiteliales de próstata en el cultivo 2D seguido de la formación de esferoides en el cultivo 3D mostró la colocación de BrdU, CFSE y Far Red en las mismas células que retienen la etiqueta. La inmunostaining dual mostró que las células retenidas de etiquetas presentan niveles más bajos de proteína de citoqueratina queratina 14, disminución de la proteína de unión celular E-cadherina, aumento de las proteínas marcadoras tempranas de células madre Wnt10b y ALDH1A1, aumento de la proteína de autofagia LC3, y aumento de la miosina IIB. Además, el ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides detecta con éxito células similares al cáncer en muestras de cáncer de próstata.
Las células cancerosas y esferoides similares a la proaño con etiqueta CFSE derivados de muestras de cáncer de próstata humanos mostraron una proteína E-cadherina reducida en relación con las células progenitoras no etiquetadas. Al intentar este protocolo, es importante mantener la matriz en forma líquida para la preparación de medios de cultivo. Guárdelo durante la noche a cuatro grados, y enfríe las puntas de la pipeta en PBS helada antes de la matriz de dosificación.
Tras el aislamiento de las células madre utilizando el ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides, se puede realizar la secuenciación de ARN de una sola célula y el análisis proteómico para identificar genes específicos y nuevos biomarcadores en células madre. El aislamiento de las células madre cancerosas vivas mediante el ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides permite a los investigadores cultivar tumoresoides derivados de células madre de cáncer in vitro y detectar nuevos fármacos contra el cáncer.
