O isolamento das células-tronco continua sendo um grande desafio devido ao co-isolamento das células progenitoras usando métodos atuais. Desenvolvemos um novo ensaio sem biomarcadores para isolar células-tronco quiescentes de progenitores mistos. A principal vantagem deste ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoides, pode expandir e isolar células-tronco vivas de seus progenitores filhas pela FACS usando a rotulagem CFSE ou Far Red.
Enquanto as terapias convencionais erradicam a maioria das células cancerígenas da próstata, as células-tronco do câncer permanecem devido à resistência terapêutica, impulsionando assim a progressão da doença. O isolamento celular semelhante a tronco permitirá a identificação de novos genes que podem ser terapeuticamente co-alvo para uma remissão eficaz da doença. Nosso ensaio de retenção de rótulos é aplicável para o isolamento normal de células-tronco de vários tecidos e células, e para a pesquisa de células-tronco do câncer.
É importante ressaltar que este ensaio é aplicável a outros cânceres epiteliais, como câncer de mama e colorretal. Comece por revestir pratos de cultura de 100 milímetros com dois mililitros de solução de fibronectina de 2,5 microgramas e incuba-los durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução e deixe os pratos de cultura secar no armário de biossegurança por 45 minutos.
Adicione nove mililitros do meio de crescimento das células epiteliais da próstata a um prato revestido de fibronectina e mantenha-o aquecido na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Descongele um frasco de células epiteliais de próstata humana congeladas em um banho de água de 37 graus Celsius, e resuspense as células em 10 mililitros de meio quente. Centrifugar a suspensão da célula a 500 vezes g durante cinco minutos.
Em seguida, aspirar e descartar o supernaspe. Resuspenque as células em um mililitro de meio de cultura quente e transfira um mililitro da suspensão diretamente para o prato revestido de fibronectina com o meio pré-aquecido. Em seguida, incubar o prato na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.
Se co-rotular as células, prepare células com rótulo brdU na cultura 2D de 10 dias, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, adicione cinco CFSE micromolar ou Far Red e incubar as células por 30 minutos. Após a incubação, aspire cuidadosamente o meio com o corante e lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS quente.
Em seguida, realize a digestão enzimática com 05% de trippsina EDTA de acordo com as instruções do manuscrito. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasce. As células foram resuspengidas em matriz de membrana de porão gelada, de um para um e cultura média para formação de prostafera 3D.
Para preparar a cultura da prostássea em um sistema de matriz de porão 3D, descongele a matriz de membrana do porão a quatro graus Celsius durante a noite e mantenha-a no gelo antes de ser usada. Em seguida, adicione suavemente um mililitro de matriz de membrana de porão gelado em um volume igual de meio de cultura gelada. Pipeta para cima e para baixo para misturar, tomando o cuidado de não introduzir bolhas de ar.
Resuspend cinco vezes 10 a 1/4 células epiteliais de próstata humana em matriz de membrana de porão gelada e mistura de mídia cultural para o volume total de 500 microlitadores. Pipete a solução para a borda inferior de cada poço e gire a placa para distribuir uniformemente a mistura. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus por 30 minutos para permitir que a matriz se solidifique.
Em seguida, cubra-o com um mililitro de cultura quente por poço, certificando-se de não perturbar o anel. Para colher as prostaferas rotuladas por CFSE substitua o meio por dois mililitros despase e pipeta para cima e para baixo para misturar várias vezes. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos para digerir a matriz, em seguida, coletar a mistura da esfera em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Centrifugar as esferas a 500 vezes g por cinco minutos e descartar o supernaspe. Resuspenque a pelota em 500 microlitadores de edta quente de 05%, e transfira-as para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Incubar as esferas a 37 graus Celsius por cinco minutos, depois adicione 500 microliters de PBS quente com 10% de FBS.
Passe-os através de uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 26 para dissociar completamente as esferas. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspirar e descartar o supernaspe.
Resuspend as células em um mililitro de meio de cultura quente com um micrograma por iodeto de propídio mililitro para manchar as células mortas e incuba-las por um minuto à temperatura ambiente. Repita a centrifugação e descarte o supernatante. Em seguida, lave as células com um mililitro de meio quente.
Repita a centrifugação e descarte o supernatante. Resuspend as células em um mililitro de meio de cultura quente e colete as células em tubos de fundo redondos de poliestireno de cinco mililitros filtrando-as através de tampas de estote de 35 mícrons de tamanho de células. Realize a análise FACS das células de prostafera com células de prostafera com rótulo CFSE dispersos de trippsina.
Usando células não rotuladas como um controle negativo e células rotuladas por CFSE como um controle positivo para definir os portões, executar a amostra para classificar e coletar as subpopulações de células fracionadas CFSE-alta e CFSE-low. As células epiteliais normais da próstata humana primária foram colocadas em pratos de cultura revestidos de fibronectina e o crescimento celular foi mantido na cultura 2D. Após a transferência para uma cultura 3D com uma matriz de membrana de porão, células epiteliais diferenciadas lentamente morreram e apenas células-tronco da próstata permaneceram.
A rotulagem dupla de células epiteliais de próstata na cultura 2D seguida pela formação esferoide na cultura 3D mostrou colocalização de BrdU, CFSE e Far Red nas mesmas células de retenção de rótulos. A imunostaining dupla mostrou que as células que retêm rótulos apresentam níveis mais baixos de queratina da proteína citokeratina 14, diminuição da proteína de junção celular E-cadherin, aumento das proteínas marcadores precoces de células-tronco Wnt10b e ALDH1A1, aumento da proteína de autofagia LC3, e aumento da miosina IIB. Além disso, o ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoides detecta com sucesso células cancerígenas semelhantes a câncer em amostras de câncer de próstata.
Células cancerígenas de retenção com rótulos CFSE e esferoides derivados de amostras de câncer de próstata humana apresentaram proteína e-cadherin reduzida em relação às células progenitoras não rotuladas. Ao tentar este protocolo, é importante manter matriz em forma líquida para preparação média da cultura. Armazene-o durante a noite a quatro graus, e esfrie as pontas da pipeta em PBS gelado antes de dispensar a matriz.
Após o isolamento das células-tronco usando o ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoide, o sequenciamento de RNA unicelular e a análise proteômica podem ser realizados para identificar genes específicos e novos biomarcadores em células-tronco. O isolamento de células-tronco de câncer vivos pelo ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoides torna possível que os pesquisadores cresçam tumoróides derivados de células-tronco do câncer in vitro e viam novas drogas anticânculares.
