L’isolement des cellules souches demeure un défi majeur en raison de la co-isolation des cellules progénitrices en utilisant les méthodes actuelles. Nous avons développé un nouvel essai sans biomarqueur pour isoler les cellules souches quiescentes des progéniteurs mixtes. Principal avantage de cet essai de rétention d’étiquettes à base de sphéroïdes, il peut élargir et isoler les cellules souches vivantes de leurs progéniteurs de fille par FACS à l’aide de l’étiquetage CFSE ou Far Red.
Tandis que les thérapies conventionnelles éliminent la plupart des cellules cancéreuses de prostate, les cellules souches cancéreuses restent dues à la résistance thérapeutique, conduisant ainsi la progression de la maladie. L’isolement cellulaire en tige permettra d’identifier de nouveaux gènes qui peuvent être co-ciblés thérapeutiquement pour une rémission efficace de la maladie. Notre analyse de conservation de l’étiquette s’applique à l’isolement normal des cellules souches de divers tissus et cellules, ainsi qu’à la recherche sur les cellules souches cancéreuses.
Fait important, cet essai s’applique à d’autres cancers épithéliales des cellules, tels que les cancers du sein et colorectal. Commencez par enduire les plats de culture de 100 millimètres de deux millilitres de solution de fibronectine de 2,5 microgrammes et incubez-les toute la nuit à température ambiante. Ensuite, aspirez la solution et laissez sécher l’air des plats de culture dans l’armoire de biosécurité pendant 45 minutes.
Ajouter neuf millilitres du milieu de croissance des cellules épithéliales de la prostate à un plat recouvert de fibronectine et le garder au chaud dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Décongeler un flacon de cellules épithéliales de la prostate humaine congelées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius, et resuspendre les cellules en 10 millilitres de milieu chaud. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 fois g pendant cinq minutes.
Puis aspirer et jeter le surnatant. Resuspendez les cellules en un millilitre de milieu de culture chaud et transférez un millilitre de suspension directement dans le plat recouvert de fibronectine avec le milieu préchauffé. Puis incuber le plat dans l’incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.
Si vous co-étiquetez les cellules, préparez les cellules étiquetées BrdU en culture 2D de 10 jours comme décrit dans le manuscrit du texte. Ajouter ensuite cinq micromolaires CFSE ou Far Red et incuber les cellules pendant 30 minutes. Après l’incubation, aspirer soigneusement le milieu avec le colorant et laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS chaud.
Ensuite, effectuez la digestion enzymatique avec 05% trypsin EDTA selon les instructions manuscrites. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Les cellules ont été résuspendus dans la matrice de membrane de sous-sol glacée, un-à-un et le mélange moyen de culture pour la formation de prostasphère 3D.
Pour préparer la culture de la prostasphère dans un système matriciel de sous-sol 3D, décongelez la matrice membranaire du sous-sol à quatre degrés Celsius pendant la nuit et gardez-la sur la glace avant utilisation. Ajouter ensuite délicatement un millilitre de matrice membranaire glacée du sous-sol dans un volume égal de milieu de culture glacé. Pipette de haut en bas pour mélanger, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air.
Resuspendez cinq fois 10 à 1/4 des cellules épithéliales humaines de prostate dans la matrice de membrane de sous-sol et le mélange de médias de culture de sous-sol glacés pour le volume total de 500 microlitres. Pipette la solution à la jante inférieure de chaque puits et tourbillonner la plaque pour répartir uniformément le mélange. Placez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre à la matrice de se solidifier.
Ensuite, couvrez-le d’un millilitre de culture chaude moyenne par puits, en s’assurant de ne pas déranger l’anneau. Pour récolter les prostasphériques étiquetés CFSE, remplacez le milieu par deux millilitres dispase et pipette de haut en bas pour mélanger plusieurs fois. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour digérer la matrice, puis recueillir le mélange de sphère dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Centrifuger les sphères à 500 fois g pendant cinq minutes et jeter le supernatant. Resuspendez la pastille dans 500 microlitres d’EDTA chaud de 05% trypsine, et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Incuber les sphères à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis ajouter 500 microlitres de PBS chaud avec 10%FBS.
Passez-les à travers une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 26 pour dissocier complètement les sphères. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes. Puis aspirer et jeter le surnatant.
Resuspendez les cellules en un millilitre de milieu de culture chaud avec un microgramme par millilitre propidium iodure pour tacher les cellules mortes et les incuber pendant une minute à température ambiante. Répétez la centrifugation et jetez le supernatant. Lavez ensuite les cellules avec un millilitre de milieu chaud.
Répétez la centrifugation et jetez le supernatant. Resuspendez les cellules en un millilitre de milieu de culture chaud et recueillez les cellules dans des tubes ronds de fond en polystyrène de cinq millilitres en les filtrant à travers des bouchons de rupture de passoire cellulaire de taille pore de 35 microns. Effectuez l’analyse FACS des cellules prostasphériques labellées CFSE dispersées par trypsine.
Utilisation de cellules non étiquetées comme un contrôle négatif et de cellules étiquetées CFSE comme un contrôle positif pour fixer les barrières, exécuter l’échantillon pour trier et recueillir les sous-populations de cellules fractionnées CFSE-haute et CFSE-basse. Les cellules épithéliales normales primaires de prostate humaine ont été placées dans les plats de culture fibronectin-enduits et la croissance cellulaire a été maintenue dans la culture 2D. Lors du transfert dans une culture 3D avec une matrice membranaire du sous-sol, les cellules épithéliales différenciées se sont lentement éteintes et seules les cellules souches de la prostate sont restées.
La double étiquetage des cellules épithéliales de prostate dans la culture 2D suivie de la formation de sphéroïdes dans la culture 3D a montré la colocalisation de BrdU, CFSE, et Far Red dans les mêmes cellules de conservation d’étiquette. L’immunostaining double a prouvé que les cellules d’étiquette-soutènement montrent des niveaux inférieurs de kératine de protéine de cytokératine 14, protéine diminuée de jonction cellulaire E-cadherin, protéines tôt de marqueur de cellules souches accrues Wnt10b et ALDH1A1, protéine autophagy accrue LC3, et iIB accru de myosine. De plus, l’analyse de rétention d’étiquettes à base de sphéroïdes détecte avec succès les cellules souches cancéreuses dans les échantillons de cancer de la prostate.
Les cellules cancéreuses et les sphéroïdes résistants étiquetés CFSE dérivés de spécimens humains de cancer de la prostate ont montré la protéine réduite d’E-cadherin par rapport aux cellules progénitrices non étiquetées. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de maintenir la matrice sous forme liquide pour la préparation moyenne de la culture. Conservez-le toute la nuit à quatre degrés et refroidissez les pointes de pipette dans du PBS glacé avant de distribuer la matrice.
Après l’isolement des cellules souches à l’aide de l’analyse de rétention d’étiquettes à base de sphéroïdes, le séquençage de l’ARN unicellulique et l’analyse protéomique peuvent être effectués pour identifier des gènes spécifiques et de nouveaux biomarqueurs dans les cellules souches. L’isolement des cellules souches cancéreuses vivantes par l’analyse de rétention d’étiquettes à base de sphéroïdes permet aux chercheurs de développer des tumoroïdes dérivés de cellules souches cancéreuses in vitro et de dépister de nouveaux médicaments anticancéreux.
