La glomerulonefritis causa lesiones glomerulares patológicas con muerte celular considerable y liberación de ADN extracelular. Este protocolo permite la visualización del ADN extracelular en el lugar de liberación durante la lesión patológica. La ventaja de esta técnica es que mide el ADN extracelular a partir de la muerte celular en el riñón.
A diferencia del suero o la orina, la medición del ADN extracelular es un marcador suplente para el daño patológico. La importancia de este método es que tanto la tinción de ADN extracelular como el análisis de imágenes son fácilmente transferibles a otras enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y el lupus. Este método requiere un conocimiento básico de la histología renal.
Para permitir la detección precisa del ADN extracelular glomerular, el investigador debe ser capaz de identificar correctamente los glomérulos. Para la tinción de ADN extracelular, primero caliente las muestras de interés en un portaobjetos en 60 grados Celsius durante 60 minutos antes de sumergir las diapositivas en dos cambios de disolvente de 40 minutos en una campana de humo. Después de la segunda inmersión, rehidratar las muestras dos veces en 100%etanol y una vez en 70%etanol durante cinco minutos por tratamiento.
Después del último tratamiento, utilice pinzas para colocar los portaobjetos en la solución de recuperación de antígenos hirviendo en una olla a presión en alto durante 10 minutos. Después de desenmascarar los epitopos del antígeno, transfiera la olla a presión del calor a un fregadero y pase inmediatamente agua fría del grifo sobre la tapa. Deje que las diapositivas se equilibren durante 20 minutos en la solución de recuperación de antígenos antes de lavar las muestras dos veces en 0,01 MOLar PBS en un agitador orbital durante cinco minutos por lavado.
Después del segundo lavado, utilice una pluma hidrófoba para dibujar círculos alrededor de las muestras de tejido renal y bloquear cualquier tinción inespecífico con 60 microlitros de 10% de suero de pollo en 5% albúmina sérica bovina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, reemplace cuidadosamente la solución de bloqueo con 60 microlitros del anticuerpo primario de interés en una cámara de humedad durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos en un agitador orbital en PBS durante dos minutos por lavado antes de añadir 60 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado a cada diapositiva para una incubación de 40 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave los portaobjetos en PBS como se ha demostrado, seguido por el tratamiento en 0,3% de negro sudanés en 70%etanol para apagar cualquier autofluorescencia potencial inducida por formalina. Después de 30 minutos, lave los portaobjetos en agua del grifo para eliminar cualquier precipitado y sumerja los portaobjetos en PBS durante 10 minutos para evitar cualquier mayor formación de precipitados negros de Sudán. Al final de la incubación, monte los portaobjetos en los cubreobjetos de vidrio confocal con tres gotas de 60 microlitros de solución de montaje complementadas con DAPI y selle los cubreobjetos con esmalte de uñas.
Deje que los portaobjetos se curen durante 24 horas a temperatura ambiente. Guárdelos a cuatro grados Cent protegidos de la luz hasta que se hagan imágenes mediante microscopía de escaneo láser confocal de acuerdo con los protocolos estándar. Asegúrese de sellar los cubreobjetos con esmalte de uñas para evitar cualquier movimiento durante la toma de imágenes y limpiar los cubreobjetos de etanol para mejorar la resolución de la imagen.
Después de tomar imágenes de 20 glomérulos por diapositiva, abra el plugin de segmentación Weka entrenable en ImageJ y suelte la primera imagen en la barra de herramientas de ImageJ. Haga clic en canales de imagen, color y división. Aparecerá una imagen que muestra la tinción primaria de anticuerpos.
Para crear un archivo combinado de las imágenes individuales, haga clic en color y combine canales. Aparecerá un cuadro emergente pidiendo que se asigne un color a cada canal. Marque las casillas crear imágenes compuestas y mantener las imágenes de origen y haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen compuesta combinada.
Usando la tinción primaria de anticuerpos como guía, dibuje una región de interés alrededor del mechón glomerular. Para realizar un desenfoque gaussiano en la imagen DAPI azul única, haga clic en proceso, filtros y desenfoque gaussiano. Ajuste el desenfoque en uno a dos.
La imagen se volverá un poco borrosa, pero los núcleos aparecerán suaves, el fondo se suavizará. A continuación, haga clic en plugins, segmentación y segmentación de Weka entrenable, y utilice la herramienta de mano libre para rastrear los núcleos intactos. Cuando se hayan agregado todos los núcleos de interés, el cuadro agregar clase uno, utilice la herramienta de línea para delinear las áreas de fondo al cuadro de clase dos.
Haga clic en Crear nueva clase y utilice la herramienta de línea para delinear el ADN extranuclear manchado de DAPI. Haga clic en clasificador de tren y obtenga probabilidad. Alternar el ratón para obtener una imagen en blanco y negro de todos los componentes con el objeto de selección resaltado en blanco.
Para duplicar esta imagen, haga clic en imagen y duplique. En imagen, ajuste y umbral. Utilice el botón del ratón para ajustar el umbral hasta que sólo se observe el ADN extracelular.
Después de la umbral, haga clic en procesar, binario y hacer binario, y copie la región glomerular generada anteriormente de interés. Pulse Control Shift E para seleccionar editar, seleccionar y restaurar para restaurar la selección. Para medir solo las partículas de ADN extracelulares dentro del glomérulo, haga clic en analizar partículas y ACEPTAR. Se generará una hoja de resultados que muestra el número de partículas, el área, los píxeles medios y el porcentaje de glomérulos que contienen ADN extracelular.
Para guardar el clasificador como clasificador de ADN extracelular, haga clic en guardar clasificador y guarde los datos. Para volver a aplicar el modelo a imágenes posteriores, repita el procesamiento de imagen inicial como se ha demostrado antes de seleccionar el clasificador de carga y el archivo clasificador guardado. El menú de registro aparecerá y ejecutará el modelo.
Una vez ejecutado el modelo, haga clic en cargar datos y seleccione el archivo extracellularDNA.arff. A continuación, haga clic en crear resultado. Si la imagen resultante no ha podido recoger todos los núcleos, el fondo o el ADN extracelular, haga clic en volver a entrenar clasificador y agregue más clasificadores según sea necesario.
Aquí, se muestran imágenes de un solo canal que muestran la tinción representativa de ADN y beta actina. La fusión de las dos imágenes permite dibujar una región de interés alrededor del área glomerular para la medición del ADN extracelular dentro de los glomérulos renales del ratón utilizando la segmentación entrenable de Weka como se ha demostrado. Este modelo se puede adoptar para identificar el ADN extracelular en muestras de biopsia renal de un paciente de control o la comparación con la de una biopsia renal de un paciente con vasculitis asociada a la mieloperoxidasa ANCA.
Además, este programa se puede traducir a otras manchas dentro de muestras de tejido renal, por ejemplo, para manchar para las trampas extracelulares de neutrófilos y la deposición de mieloperoxidasa extracelular en vasculitis asociada a ANCA. Es importante destacar que no se observan diferencias significativas cuando varios usuarios analizan los mismos datos. El paso más crítico del análisis es proporcionar suficientes ejemplos de antecedentes, núcleos y ADN extracelular con glomérulos como clasificadores para el programa de segmentación de Weka para aprender de.
Este método es fácilmente transferible. Por ejemplo, se puede investigar un análisis adicional de los diferentes tipos de muerte celular a través de la tinción de anticuerpos específicos contra marcadores de apoptosis o necrosis. Nuestra técnica se puede utilizar con otros procesos inflamatorios como la evaluación de la expresión TLR en la enfermedad renal autoinmune o la expresión mieloperoxidasa extracelular en biopsias renales humanas.
