Este método se utiliza para evaluar la motilidad del cultivo a través de contar la contracción del cultivo y detectar la distribución de alimentos sólo en el digestivo. La ventaja de esta técnica es que está evaluando continuamente la motilidad de los cultivos. Es de bajo costo y fácil de realizar.
Este método hace posible utilizar sólo relleno como un modelo para estudiar la función digestiva en los pasajes de alimentos en el tracto gastrointestinal. Ayudar a demostrar el proceso será Junmeng Xi, un estudiante graduado de mi laboratorio. Mantener las moscas en viales que contengan 10 mililitros de alimentos recién hechos en una incubadora de 25 grados centígrados con 60% de humedad y un ciclo de 12 horas de luz, 12 horas de oscuridad.
Asegúrese de que un gran número del fenotipo deseado vuela eclosionar simultáneamente mediante el cultivo de moscas jóvenes con alimentos estándar con levadura seca y luego transferir las moscas adultas a un vial con levadura húmeda y permitir dos días para la puesta de huevos. Deje que los huevos en la incubadora se desarrollen y transfieran moscas adultas a un nuevo vial para recoger más huevos. Recoger las moscas macho o hembra eclosed cada día y cultivarlos en viales nuevos con alimentos estándar a la edad deseada.
Anestesar las moscas con dióxido de carbono y transferir una mosca a una placa de disección bien con 200 microlitros de PBS. Sujeta la mosca en su tórax con un par de pinzas y abre el tórax con otro par de pinzas y luego tira de los extremos en direcciones opuestas para abrir el abdomen. Tome cuidadosamente la cosecha y el intestino fuera del cuerpo y esperar a que la mosca se despierte.
Cuando la mosca esté despierta, cuente el número de veces que el cultivo se contrae en un minuto. Repita el conteo de contracciones cinco veces, esperando 30 segundos entre cada conteo. Pesar el tinte azul y disolverlo en PBS a una concentración del 20%.
A continuación, revuelva en el alimento de mantenimiento líquido hervido a una concentración final del 5% durante el proceso de enfriamiento de los alimentos. Después de mantener las moscas en viales con alimentos de hambre durante cuatro horas, transfiéralas a nuevos viales con los alimentos teñidos y cultiva los alimentos durante el tiempo deseado, teniendo en cuenta que en condiciones de mantenimiento el alimento pasa a través de la mosca en unas dos horas. Transfiera una mosca anestesiada a un pozo de placa de disección que contenga 200 microlitros de PBS.
Use pinzas para agarrar la mosca en el tórax y retire la cabeza con otro par de pinzas, luego transfiera el cuerpo a un nuevo pozo con PBS y lávelo con un suave temblor para eliminar el tinte unido al cuerpo. Abra el abdomen con dos pares de pinzas y separe cuidadosamente todo el intestino del cuerpo. Saque el cultivo de todo el intestino y colótelo en un tubo con 100 microlitros de PBS.
Ponga el resto del intestino en otro tubo con 100 microlitros de PBS y luego use puntas de pipeta para moler el cultivo y el intestino y disolver el tinte en PBS. Repita la disección hasta que se recojan suficientes cultivos y tripas. Después de recoger las muestras, centrifugar los tubos a la velocidad más alta durante un minuto y transferir 90 microlitros de sobrenadante a pozo de una placa de 96 pozos.
Hacer una serie de diluciones de tinte azul estándar a concentraciones de uno por 10 a la 7 a 10 a los 4 gramos por mililitro y añadirlos a los pozos. Mida la absorbancia a 630 nanómetros de los pozos y utilice las mediciones estándar para trazar un gráfico de líneas de absorbancia vs concentración de tinte. A continuación, utilice la curva para calcular la concentración de tinte de las muestras.
El ensayo de motilidad de cultivos se utilizó para contar las contracciones de los cultivos en moscas mutantes NPRL de tres días de edad y controles genéticos de antecedentes. Se encontró que la mutación disminuyó significativamente la tasa de contracción de los cultivos. Para confirmar aún más la función de NPRL2 en el cultivo, el movimiento de los alimentos se detectó alimentando alimentos teñidos a las moscas.
Todas las moscas tenían cantidades similares de tinte en el cultivo, pero las moscas NPRL2 tenían menos tinte en el intestino que puede estar asociado con la disminución de la tasa de contracción del cultivo. Al escribir este protocolo, asegúrese de que el cultivo permanezca en contacto con el cuerpo y que la mosca esté viva y despierta. De lo contrario, el cultivo perderá la capacidad de contraerse.
Durante el proceso de disección, el cultivo y el intestino deben estar en contacto. Si el tinte se filtra en el medio de disección, la muestra ya no se puede utilizar. Vamos a llenar nuestro apetito y la expulsión de alimentos en poco tiempo también se puede evaluar mediante la detección de la cantidad de tinte en todo el intestino.
