Questo metodo viene utilizzato per valutare la motilità delle colture attraverso il conteggio della contrazione delle colture e il rilevamento della distribuzione alimentare solo nell'digestivo. Il vantaggio di questa tecnica è che valuta continuamente la motilità delle colture. È a basso costo e facile da eseguire.
Questo metodo consente di utilizzare solo filler come modello per studiare la funzione digestiva sui passaggi alimentari nel tratto gastrointestinale. Ad aiutare a dimostrare il processo sarà Junmeng Xi, uno studente laureato del mio laboratorio. Mantenere le mosche in fiale contenenti 10 millilitri di cibo appena fatto in un incubatore di 25 gradi Celsius con umidità del 60% e un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di buio.
Assicurarsi che un gran numero del fenotipo desiderio vola chiudere contemporaneamente coltivando giovani mosche con cibo standard con lievito secco, quindi trasferire le mosche adulte in una fiala con lievito umido e consentire due giorni per la deposizione delle uova. Lascia le uova nell'incubatrice per sviluppare e trasferire le mosche adulte in una nuova fiala per raccogliere più uova. Raccogli le mosche maschili o femminili echiuse ogni giorno e colti in nuove fiale con cibo standard all'età desiderata.
Anestetizzare le mosche con anidride carbonica e trasferire una mosca in una piastra di sezionazione bene con 200 microlitri di PBS. Afferrare la mosca al suo torace con un paio di pinzette e aprire il torace con un altro paio di pinzette, quindi tirare le estremità in direzioni opposte per aprire l'addome. Prendi con cura il raccolto e l'intestino dal corpo e aspetta che la mosca si svegli.
Quando la mosca è sveglia, conta il numero di volte in cui il raccolto si contrae in un minuto. Ripeti il conteggio della contrazione cinque volte, aspettando 30 secondi tra ogni conteggio. Pesare il colorante blu e scioglierlo in PBS a una concentrazione del 20%.
Quindi mescolarlo nel cibo bollito per la manutenzione del liquido a una concentrazione finale del 5% durante il processo di raffreddamento degli alimenti. Dopo aver tenuto le mosche in fiale con cibo da fame per quattro ore, trasferirle in nuove fiale con il cibo tinto e culturarle per il tempo desiderato, tenendo presente che in condizioni di manutenzione il cibo passa attraverso la mosca in circa due ore. Trasferire una mosca anestetizzata in una piastra di sezionatura contenente ben 200 microlitri di PBS.
Utilizzare una pinzetta per afferrare la mosca al torace e rimuovere la testa con un altro paio di pinzette, quindi trasferire il corpo in un nuovo pozzo con PBS e lavarlo con delicati scuotimenti per rimuovere il colorante attaccato al corpo. Aprire l'addome con due paia di pinzette e separare accuratamente l'intero intestino dal corpo. Togliere il raccolto da tutto l'intestino e metterlo in un tubo con 100 microlitri di PBS.
Mettere il resto dell'intestino in un altro tubo con 100 microlitri di PBS, quindi utilizzare punte di pipetta per macinare il raccolto e l'intestino e sciogliere il colorante in PBS. Ripetere la dissezione fino a quando non vengono raccolte abbastanza colture e budella. Dopo aver raccolto i campioni, centrifugare i tubi alla massima velocità per un minuto e trasferire 90 microlitri di supernatante in pozzo di una piastra da 96 potte.
Fai una serie di diluizioni di coloranti blu standard a concentrazioni da uno per 10 a 7 a 10 al 4 ° grammi per millilitro e aggiungili ai pozzi. Misurare l'assorbanza a 630 nanometri dei pozzi e utilizzare le misure standard per tracciare un grafico di linea di assorbanza rispetto alla concentrazione di colorante. Quindi utilizzare la curva per calcolare la concentrazione di colorante dei campioni.
Il test di motilità delle colture è stato usato per contare le contrazioni delle colture su mosche mutanti NPRL vecchie di tre giorni e controlli genetici dello sfondo. La mutazione è stata trovata per diminuire significativamente il tasso di contrazione delle colture. Per confermare ulteriormente la funzione di NPRL2 sul raccolto, il movimento del cibo è stato rilevato alimentando il cibo tinto alle mosche.
Tutte le mosche avevano quantità simili di colorante nel raccolto, ma le mosche NPRL2 avevano meno colorante nell'intestino che può essere associato alla diminuzione del tasso di contrazione delle colture. Quando digiti questo protocollo, assicurati che il raccolto rimanga a contatto con il corpo e che la mosca sia viva e sveglia. In caso contrario, il raccolto perderà la capacità di contrarsi.
Durante il processo di dissezione, il raccolto e l'intestino devono essere in contatto. Se la tintura perde nel mezzo di dissezione, il campione non può più essere utilizzato. Riempiamo il nostro appetito e l'espulsione del cibo in breve tempo può anche essere valutata rilevando la quantità di colorante in tutto l'intestino.
