Cette méthode est utilisée pour évaluer la motilité des cultures en comptant la contraction des cultures et en détectant la distribution des aliments dans le digestif. L’avantage de cette technique est qu’elle évalue continuellement la motilité des cultures. C’est peu coûteux et facile à exécuter.
Cette méthode permet d’utiliser juste remplissage comme un modèle pour étudier la fonction digestive sur les passages alimentaires dans le tractus gastro-intestinal. Junmeng Xi, un étudiant diplômé de mon laboratoire, aidera à démontrer le processus. Maintenir les mouches dans des flacons contenant 10 millilitres d’aliments fraîchement faits dans un incubateur de 25 degrés Celsius avec 60% d’humidité et une lumière de 12 heures, 12 heures de cycle sombre.
Assurez-vous qu’un grand nombre de mouches phénotype désir eclos simultanément en culturant les jeunes mouches avec des aliments standard avec de la levure sèche, puis transférer les mouches adultes à un flacon avec de la levure humide et laisser deux jours pour la ponte. Laissez les œufs dans l’incubateur pour développer et transférer les mouches adultes dans un nouveau flacon pour recueillir plus d’œufs. Recueillir les mouches mâles ou femelles eclosed chaque jour et les culture dans de nouveaux flacons avec des aliments standard à l’âge désiré.
Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone et transférer une mouche dans une plaque de dissectation bien avec 200 microlitres de PBS. Saisissez la mouche à son thorax avec une paire de pinces à épiler et ouvrez le thorax avec une autre paire de pinces puis tirez les extrémités dans des directions opposées pour ouvrir l’abdomen. Prenez soigneusement la récolte et l’intestin hors du corps et attendez que la mouche se réveille.
Lorsque la mouche est éveillée, comptez le nombre de fois que les contrats de culture sont conclus en une minute. Répétez la contraction en comptant cinq fois, en attendant 30 secondes entre chaque décompte. Peser le colorant bleu et le dissoudre dans PBS à une concentration de 20%.
Puis remuer dans les aliments bouillis d’entretien liquide à une concentration finale de 5% pendant le processus de refroidissement des aliments. Après avoir gardé les mouches dans des flacons avec de la nourriture affamée pendant quatre heures, transférez-les dans de nouveaux flacons avec la nourriture et la culture des aliments et de la culture pour le temps désiré, en gardant à l’esprit que dans des conditions d’entretien de la nourriture passe par la mouche en environ deux heures. Transférer une mouche anesthésiée dans un puits de plaque disséquant contenant 200 microlitres de PBS.
Utilisez des pinces à épiler pour saisir la mouche au thorax et enlever la tête avec une autre paire de pinces à épiler, puis transférer le corps à un nouveau puits avec PBS et le laver avec des secousses douces pour enlever le colorant attaché au corps. Ouvrez l’abdomen avec deux pinces à épiler et séparez soigneusement tout l’intestin du corps. Enlever la récolte de tout l’intestin et la mettre dans un tube avec 100 microlitres de PBS.
Mettez le reste de l’intestin dans un autre tube avec 100 microlitres de PBS, puis utilisez des pointes de pipette pour moudre la culture et l’intestin et dissoudre le colorant dans PBS. Répétez la dissection jusqu’à ce que suffisamment de cultures et d’intestins soient recueillis. Après avoir prélevé les échantillons, centrifugez les tubes à la vitesse la plus élevée pendant une minute et transférez 90 microlitres de supernatant au puits d’une plaque de puits de 96 puits.
Faire une série de dilutions de colorant bleu standard à des concentrations d’une fois 10 à 7 à 10 au 4e grammes par millilitre et les ajouter aux puits. Mesurez l’absorption à 630 nanomètres des puits et utilisez les mesures standard pour tracer un graphique linéaire de l’absorption par rapport à la concentration de colorants. Ensuite, utilisez la courbe pour calculer la concentration de colorant des échantillons.
L’analyse de motilité des cultures a été utilisée pour compter les contractions des cultures sur les mouches mutantes NPRL vieilles de trois jours et les contrôles génétiques de fond. La mutation s’est trouvée pour diminuer de manière significative le taux de contraction de récolte. Afin de confirmer davantage la fonction de NPRL2 sur la culture, le mouvement des aliments a été détecté en alimentant les mouches en les alimentant.
Toutes les mouches avaient des quantités similaires de colorant dans la culture, mais les mouches NPRL2 avaient moins de colorant dans l’intestin, ce qui peut être associé à la diminution du taux de contraction des cultures. Lorsque vous tapez ce protocole, assurez-vous que la culture reste en contact avec le corps et que la mouche est vivante et éveillée. Dans le cas contraire, la récolte perdra la capacité de se contracter.
Pendant le processus de dissection, la culture et l’intestin doivent être en contact. Si le colorant s’écoule dans le milieu de dissection, l’échantillon ne peut plus être utilisé. Remplissons simplement notre appétit et l’éjection alimentaire dans un court laps de temps peut également être évaluée en détectant la quantité de colorant dans l’intestin entier.
