Este protocolo describe un método rápido y simple para generar cultivos primarios de melanocitos y fibroblastos a partir de ratones. Debido a que esta técnica no requiere que la epidermis y la dermis estén separadas, se puede realizar de forma rápida y consistente con un entrenamiento mínimo. Este método se puede utilizar para estudiar la melación cutánea y la biología de los fibroblastos.
Los experimentos en estos cultivos pueden proporcionar información relevante para el cáncer, la cicatrización de heridas y defectos de pigmentación. Antes de empezar, asegúrese de preparar todos los reactivos necesarios y comprobar la temperatura del baño de agua. Si tiene previsto procesar varias muestras, consulte la guía de escalado de reactivos en la tabla uno.
Demostrar este procedimiento estará Brandon Murphy, un estudiante graduado de mi laboratorio. En un armario de flujo laminar, enrolle brevemente el tronco de cada ratón eutanizado en un plato estéril de Petri que contenga 70% de etanol. Retire el ratón del etanol y colóquelo en un plato estéril vacío de Petri.
A continuación, esterilizar las tijeras quirúrgicas en 70%etanol. Utilice estas tijeras para hacer una incisión en la piel en el lado ventral del tronco, comenzando desde el cuello y continuando hasta la cola. Usando fórceps estériles, pela la piel del tronco del ratón, y elimina el exceso de tejido adiposo del lado dérmico de la piel.
Coloque la piel, dermis lado hacia abajo, en un plato de seis pozos que contenga tres mililitros de 1X solución antimicótica antibiótica. Incubar a temperatura ambiente durante dos a tres minutos. A continuación, encienda el helicóptero de tejido y ajuste los ajustes a los que se muestran aquí.
Asegúrese de tener cuidado al instalar la cuchilla del helicóptero de tejido y al operar la máquina. Transfiera la piel, dermis de lado hacia abajo, a una placa de helicóptero de tejido estéril y pase la piel completamente a través del helicóptero de tejido tres veces. Después de esto, transfiera la piel homogeneizada a un tubo cónico estéril de 15 mililitros que contenga tres mililitros de tampón de digestión de la piel.
Con una microtumeta P1000, mezcle la suspensión resultante pipeteando hacia arriba y hacia abajo vigorosamente de 10 a 15 veces. Tapa el tubo cónico e incuba la muestra en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos, asegurándote de invertir el tubo cada tres a cinco minutos. A continuación, centrifugar el tubo en un rotor de cubo oscilante a 750 veces G a temperatura ambiente durante cinco minutos para peletizar las células en la piel homogeneizar.
Utilice una microtubo P1000 para eliminar lenta y completamente el tampón de digestión de la piel, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Asegúrese de aspirar de todo el tampón de digestión de la piel. Si usted está teniendo problemas, lavar el pellet celular con dos a tres mils de medios de melanocitos y repetir la centrifugación y eliminar el exceso de tampón de digestión de la piel.
A continuación, resuspender a fondo el pellet celular en un mililitro de medios de melanocitos pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15 a 20 veces con una pipeta P1000. Transfiera la solución celular resultante deje caer sabiamente a un pozo sin recubrimiento en un plato de seis pozos que contenga un mililitro de medios de melanocitos. Incubar la piel cromada homogeneizada en una incubadora de cultivo de tejido a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 40 minutos.
Después de esto, transferir la cultura sobrenadante del plato sin recubrimiento a un pozo de un colágeno prelavado recubierto de seis platos bien. Añadir G-418 a los medios, de modo que la concentración final sea de 100 nanogramos por mililitro. Agregue dos mililitros de medios de fibroblastos a un pozo del plato sin recubrimiento que ahora contiene fibroblastos adherentes.
Incubar ambos cultivos durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de 16 a 24 horas de incubación, aspirar por separado los medios de comunicación y cualquier escombro de cada cultivo. Lave cada plato dos veces usando un mililitro de PBS para cada lavado.
A continuación, agregue dos mililitros de medios de melanocitos frescos al cultivo de melanocitos y agregue dos mililitros de medios de fibroblastos frescos al cultivo de fibroblastos. En este estudio, los cultivos de fibroblastos y melanocitos se generan simultáneamente a partir de la misma muestra de piel. Cuando la piel homogeneizada se plancha por primera vez, el medio aparece turbio.
Sin embargo, después de la incubación, los conglomerados celulares más grandes y los fibroblastos de células adherentes se hacen visibles en el plato. Las células no adherentes del cultivo se transfieren a un plato recubierto de colágeno y se tratan con G-418. Los fibroblastos muertos por el G-418 se ven flotando en el medio de cultivo de melanocitos durante los próximos cinco días.
Después de cuatro a cinco días en cultivo, los melanocitos chapados comienzan a tomar un fenotipo dendrítico con gránulos melanocitos. Este fenotipo persiste al pasar, mientras que se pierden racimos de queratinocitos contaminantes. La pureza de los cultivos de melanocitos y fibroblastos resultantes se confirma utilizando citometría de flujo.
La expresión del marcador de melanocitos GP100 es específica de los cultivos de melanocitos, mientras que el marcador de fibroblastos, FSP1, se encuentra únicamente en los fibroblastos primarios. Las células de queratinocitos C59 de control son los únicos cultivos que manchan positivo para el marcador de queratinocitos, K14. Se realizan análisis adicionales para determinar cuánto tiempo se tarda en establecer cultivos de melanocitos enriquecidos.
Las células positivas GP100 comienzan a aparecer en el día cuatro y pico después de 10 días en el cultivo. Este procedimiento se puede utilizar para generar rápidamente cultivos de melanocitos y fibroblastos para una variedad de ensayos omicos in vitro y de alto rendimiento.
