Parásitos del paludismo, como los que cumplen los mosquitos, desempeñan un papel importante en la propagación de la enfermedad. Hasta ahora, ha sido imposible criar mosquitos de malaria sin sangre. Y para superar esta limitación, nuestro protocolo describe una dieta de sucedáneo en sangre que es capaz de apoyar la cría de mosquitos en la insectoría.
El uso de la dieta libre de sangre es muy ventajoso sobre la sangre. Una dieta libre de sangre no tiene las limitaciones éticas como el uso de sangre humana, o animales experimentales. Reemplazar animales en experimentación es parte de nuestra política de tres R.
Reemplazar, reducir, refinar. El uso de sangre reduce los costos, y la logística asociada con la recolección, almacenamiento y mantenimiento de sangre roja. El uso de dietas artificiales puede facilitar las pruebas de moléculas anti plasmodio.
Hasta ahora, hemos probado nuestras dietas utilizando diferentes especies de anopheles. En todas ellas, la dieta estaba bien engordada por las hembras y permitía la producción y puesta de huevos. Creemos que esta dieta tiene un uso potencial para la cría de otras especies de mosquitos.
En realidad, ahora lo estamos probando para detectar aedes, un vector de muchas enfermedades como el dengue, el virus zika o la fiebre amarilla. Mantener anopheles coluzzii yaonde colar los mosquitos en una habitación a 26 grados Celsius, 75% de humedad, y bajo un ciclo de oscuridad clara de 12 horas a 12 horas. Los mosquitos de la casa que utilizan las condiciones estándar de insectos en una sola jaula para garantizar el apareamiento.
Use una pipeta de plástico para recoger las pupas de mosquitos en un recipiente de agua pequeño. Coloque el recipiente dentro de una jaula de mosquitos para permitir que los mosquitos adultos surjan y se aparejan. Proporcionar 10%solución de alimentación de glucosa en la jaula.
Tres días después de la aparición, utilice un aspirador para recoger el número necesario de hembras de la jaula de almacenamiento en una taza de papel. Para distinguir, las hembras son más grandes y los machos tienen una probóscide más ancha y emplumada. Un día antes de los senderos de alimentación, retire la solución de alimentación de 10%glucosa.
Al día siguiente, preparar dietas líquidas artificiales en condiciones estériles en el gabinete de flujo laminar según el manuscrito. Agregue todos los ingredientes a un tubo de plástico. Mezcle todos los ingredientes a fondo y filtre con un microfiltro de 0,45 micras.
Llene una jeringa estéril de 1 mililitro equipada con una aguja de media pulgada de calibre 27 con 100 microlitros de una miligramo por mililitro de heparina. Luego, anestesia de seis a ocho semanas de edad CD una hembra ratones con ketamina y xilazina utilizando la vía intra peritoneal. Evalúe si el ratón muestra alguna reacción muscular y respuesta a diferentes estímulos físicos.
Realice la punción cardíaca. Luego recoge la sangre del ratón en un micro tube y mantén la sangre a 37 grados Celsius en un baño de agua. A continuación, recoger aproximadamente 30 mosquitos hembra de la jaula de almacenamiento utilizando un aspirador.
Transfiera los mosquitos hembra a vasos de papel de 500 mililitros y cúbralos con una fina malla de mosquitera para que no puedan escapar. Estirar la membrana del parafilm a través de la boca del alimentador de vidrio para contener la comida. Aplique un aparato de alimentación artificial de campana de vidrio conectado a tubos de plástico en la parte superior de cada taza.
Proporcionar un flujo de agua constante a la tubería cilíndrica y alimentador para que la temperatura interior se mantenga en aproximadamente 37,5 grados Celsius. Aplique un mililitro de dieta líquida precalentada a 37 grados centígrados o sangre fresca de ratón en un alimentador de vidrio. Alimente a los mosquitos durante 60 minutos en la oscuridad en 26 grados centígrados.
Después de la alimentación artificial, anestesia el frío de los mosquitos a 20 grados centígrados durante 30 segundos. A continuación, coloque los mosquitos en un plato de Petri refrigerado. Registre el número de mosquitos hembra completamente engordados.
Separe a 30 hembras completamente engordadas y colóquelas en una nueva jaula. Ahora, coloque un papel de filtro humidificado en la parte inferior de cada jaula. Mantenga a los mosquitos a 26 grados centígrados, 75% de humedad y menos de un ciclo oscuro claro de 12 horas a 12 horas con un 10% de ad libitum de glucosa.
A las 96 horas y 120 horas después de la alimentación, cuente los huevos con la ayuda de una lupa de mano. Inundar el papel de filtro con agua destilada para recoger los huevos en bandejas llenas de agua destilada. Alimentar las larvas diariamente con aproximadamente 13 miligramos de alimentos de pescado molido por bandeja.
Retire las pupas y larvas muertas con una pipeta de plástico diariamente. Cuando todas las pupas se hayan convertido en adultos, cuente el número de machos y hembras adultos, registre las fechas de eclosión y muerte, y calcule las tasas de mortalidad. Para comprobar la longevidad, recoge 15 machos adultos y 15 hembras adultas de la generación F1 de cada grupo de dieta en una taza de papel.
Alimente a los adultos con 10% de solución de glucosa ad libitum. Usa pinzas o un cepillo para eliminar a los adultos muertos todos los días. Mantener los mosquitos a la misma temperatura, humedad, condiciones de ciclo de luz y régimen de alimentación de azúcar.
Registre las fechas de defunción y calcule la longevidad. Para medir la longitud de las alas, anestesia en frío a los mosquitos machos y hembras adultos de F1 de cada grupo de dieta a 20 grados centígrados durante 90 segundos. Bajo un estereoscopio, agarre suavemente el tórax de cada mosquito con fórceps y colóquelos hacia arriba.
Recoger ambas alas usando un bisturí, y colocarlas en un portaobjetos limpio del microscopio que contenga una gota seca de medio de montaje para su posterior medición utilizando un ocular graduado. Mida la longitud del ala con un estereoscopio utilizando un micrómetro. En este estudio, se comparó el rendimiento de los mosquitos anopheles femeninos alimentados con la rica comida artificial formulada y los mosquitos alimentados con la dieta líquida inicial, o una comida de sangre fresca.
El número de mosquitos hembra engordados alimentados con harina artificial rica al 89% fue significativamente mayor que el número de mujeres engordadas alimentadas con sangre al 56%La generación F1 de mosquitos alimentados con la sangre o la comida artificial rica tenía tasas comparables de mortalidad y supervivencia. La variabilidad fue mayor en la sangre alimentada con mosquitos en relación con los mosquitos alimentados con la rica comida artificial. En términos de tamaño corporal adulto, los mosquitos F1 anopheles alimentados con rica comida artificial estaban dentro del rango esperado, y era similar a los mosquitos insectíes alimentados con sangre.
En mi opinión, es muy importante montar los alimentadores correctamente con el parafilm parafilm para evitar su ruptura. Si la membrana no está bien unida al alimentador de vidrio, puede perder la comida y probablemente perder algunos de los mosquitos, ya que pueden ser cubiertos por la comida y morir. Nos gustaría realizar un ensayo de atracción de doble elección, por ejemplo, utilizando un olfatometidor para que realmente podamos evaluar si nuestras hembras se sienten más atraídas por la dieta artificial o por la sangre.
Además, ahora estamos liofilizando la dieta artificial y estudiando su estabilidad entre diferentes temperaturas durante mucho tiempo. Además de las mejoras obvias en la estabilidad y el almacenamiento en las que hemos estado trabajando, se debe investigar el uso a largo plazo de la dieta sobre la aptitud y la fisiología de los mosquitos. Creo que producir los anófelos sin sangre facilitará la investigación y la implementación inmensamente de vectores de herramientas de control que dependen de un gran número de mosquitos.
