Agradecemos a Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai y Trevor Sorrells por sus comentarios sobre los manuscritos, y Zhongyan Gong y Kyrollos Barsoum por asistencia técnica. Agradecemos a Alex Wild por las fotografías utilizadas en la Figura 1. K.V. recibió el apoyo de la beca de doctorado Boehringer Ingelheim Fonds. V.J. fue compatible en parte con NIH T32-MH095246. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención a la Universidad Rockefeller del Instituto Médico Howard Hughes a través del programa James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study a V.J. Este material se basa en el trabajo apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca No. NSF DGE-1325261 a V.J. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión o recomendación expresada en este material son las del autor o autores y no reflejan necesariamente las opiniones de la Fundación Nacional de Ciencias.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Para muchas aplicaciones de laboratorio, los alimentadores de membrana artificial ofrecen beneficios distintos en comparación con los huéspedes vivos al permitir a los investigadores la capacidad de manipular directamente el contenido de la comida. Aunque hay múltiples métodos disponibles para la alimentación por membrana artificial, el método descrito aquí ofrece ventajas en flexibilidad, costo y rendimiento. En comparación con otros alimentadores de membranas comerciales, el ensayo de Glytube requiere un pequeño volumen de comida, lo que lo convierte en un mecanismo de entrega eficiente para reactivos costosos, incluidos fármacos o patógenos, minimizando el volumen total requerido7,35. A medida que las comidas salinas y artificiales sin proteínas promueven el engorgement, los compuestos o patógenos se pueden agregar a cualquiera de las comidas como una alternativa de alto rendimiento y no invasiva a las inyecciones. Además, cada componente del Glytube se puede lavar, reemplazar o escalar fácilmente para entregar y cuantificar múltiples tipos de comidas sin contaminación cruzada del aparato de alimentación.
Para cuantificar los volúmenes de comida consumidos por los mosquitos, el método basado en la fluorescencia permite una cuantificación más precisa del tamaño de las comidas que pesar a los mosquitos antes y después de la alimentación. Cabe señalar que este método es un ensayo de punto final. Por el contrario, el pesaje permite mantener vivos a los mosquitos para una mayor experimentación. Mediante el uso de un lector de placas, el método basado en la fluorescencia se puede escalar fácilmente para la cuantificación de alto rendimiento de las comidas consumidas por cientos de hembras individuales.
Para lograr altas tasas de alimentación, debe haber una combinación de suficientes señales de huésped para activar el comportamiento femenino de búsqueda de huésped y atraer a las hembras al alimentador. Si los mosquitos no se amontonan debajo del Glytube, es posible que la comida no se caliente correctamente o que el parto con CO2 no sea suficiente. La adición de olor humano a la superficie de la membrana aumenta de forma fiable el atractivo de la membrana artificial. Si se observan mosquitos debajo del Glytube pero no se alimentan, la composición de la comida puede tener la culpa. Las hembras no pueden alimentarse si la comida en sí no está caliente, la sangre es demasiado vieja, o si los aditivos de la comida son intrínsecamente aversivos o causan una reacción química indeseable36. Atp adicional también aumenta confiablemente las tasas de alimentación y se puede escalar hasta una concentración final de 2 mM en cada una de las recetas proporcionadas. Las hembras pueden no alimentarse si el parafilm no se tira tenso a través de la tapa de Glytube; el parafilm debe ser uniformemente transparente y no debe hebilla, ya que esto evita que la hembra sea capaz de perforar eficazmente el parafilm con su stylet. Si la comida se filtra a través del Glytube en la malla, el parafilm puede haberse roto durante el proceso de estiramiento y debe ser reemplazado.
Cambiar la composición de las comidas también puede permitir a los investigadores manipular el tiempo necesario para limpiar la comida del midgut, así como el comportamiento posterior de búsqueda de anfitriones. Las comidas presentadas aquí requieren 24-36 h para la digestión7 similar a la sangre derivada de animales. Después de alimentarse de cualquiera de estas comidas, las hembras suprimirán la búsqueda del huésped durante la ventana de tiempo de digestión. Dado que la comida salina carece de proteínas, las hembras regresan a la búsqueda del huésped después de que la comida se borra. Si es deseable un retorno más rápido, los investigadores pueden elegir comidas salinas alternativas de "limpieza rápida" que se excretan en aproximadamente 6 h27. Mientras que la composición de la comida salina presentada aquí se combina para comparar directamente los resultados con la harina de sangre artificial, la comida de "limpieza rápida" coincide más estrechamente con los niveles de sal fisiológica que se encuentran en la sangre de vertebrado.
Los métodos descritos aquí tienen limitaciones que deben ser consideradas antes de seleccionar el ensayo que es más adecuado para los objetivos experimentales del investigador. Las mediciones de fluoresceína descritas no permiten que los mosquitos se vuelvan a utilizar para la experimentación adicional. Sin embargo, las mediciones de peso se pueden tomar antes de la cuantificación del tamaño de la comida utilizando el ensayo de fluoresceína. Si el peso y el tamaño de las comidas son consistentes en múltiples ensayos para una comida determinada, el peso se puede utilizar como proxy en futuros experimentos. Además, este protocolo no distingue entre los déficits en la búsqueda de acogida frente a los comportamientos de alimentación sanguínea; los mosquitos que muestren deficiencias en la búsqueda del alimentador de membranas tendrán una reducción en las tasas de alimentación y/o en el tamaño de las comidas. Al agregar una cámara para registrar el comportamiento a lo largo del ensayo, los investigadores pueden determinar si las hembras no pueden encontrar el Glytube, o si encuentran el Glytube, pero no se alimentan.
El ensayo descrito aquí se puede adaptar para explorar muchas preguntas pendientes relacionadas con el comportamiento de alimentación en mosquitos. Por ejemplo, la contribución de proteínas sanguíneas específicas se puede explorar alterando la proporción de proteínas constituyentes o la concentración total de proteínas en la harina de sangre artificial. Para evaluar el tamaño de las comidas de múltiples eventos de alimentación, se pueden añadir colorantes con espectros de fluorescencia distintos para diferenciar las comidas de fuentes únicas37. Este protocolo también se puede modificar para estimular por separado las partes internas de la boca que detectan la sangre y que se utilizan para la ingestión (es decir, stylet), y los apéndices quimioensory que contactan con la piel (es decir, labium, piernas) como el mosquito aterriza para comenzar la alimentación de la sangre36. Por ejemplo, si los ligandos se añaden directamente a la comida, no se contactan con el labium y las piernas, ya que la membrana es perforada sólo por la stylet. Si los ligandos se añaden a la superficie exterior del parafilm en su lugar, permanecen separados de la comida y pueden ser contactados por el labium y las piernas36. Por último, la cinética detallada del comportamiento de la alimentación sanguínea no se entiende bien y el método presentado aquí podría modificarse para combinar el seguimiento de alta resolución con herramientas de aprendizaje automático para extraer lecturas conductuales de locomoción, postura y dinámica de alimentación38.
Este protocolo está dirigido a ser fácil de usar y rentable, con la capacidad de servir a los investigadores que emplean manipulaciones farmacológicas y genéticas para estudiar la alimentación de mosquitos en la sangre y el comportamiento posterior a la alimentación de la sangre.

Presentamos un protocolo para alimentar comidas de sangre modificadas a los mosquitos Aedes aegypti utilizando un alimentador de membrana artificial y midiendo con precisión el volumen de comida consumido por cada mosquito individual. Este protocolo se puede adaptar de forma flexible para alterar el contenido de la comida o para comparar el volumen de comidas consumido por diferentes grupos experimentales de mosquitos.
El mosquito Ae. aegypti amenaza la salud mundial al propagar patógenos que causan enfermedades como la fiebre amarilla, el dengue, el chikungunya y el zika1,2,3,4,5. Las hembras ae. aegypti son obligadas a alimentar la sangre; deben consumir sangre vertebrada para obtener la proteína necesaria para el desarrollo del huevo, y cada embrague de huevos requiere una comida completa en la sangre de al menos un huésped6,7,8. El mosquito hembra primero muerde a su huésped perforando la piel con su estilización e inyectando saliva, que contiene compuestos que desencadenan la respuesta inmune del huésped9. Luego se alimenta bombeando sangre a través de su estilo en su midgut. Mientras consume una comida de sangre de un huésped infectado, puede ingerir patógenos transmitidos por la sangre6,8, que luego migran desde el midgut del mosquito a sus glándulas salivales10. Los mosquitos hembra infectados de esta manera pueden propagar la enfermedad inyectando patógenos junto con saliva al picar a los huéspedes posteriores11,12. Comprender y cuantificar los mecanismos del comportamiento de la alimentación sanguínea son medidas cruciales para controlar la transmisión de enfermedades transmitidas por mosquitos.
Muchos protocolos de laboratorio para la cría y experimentación de mosquitos utilizan animales vivos, incluidos ratones, conejillos de indias o humanos como fuente de sangre13,14,15,16. El uso de animales vivos impone preocupaciones éticas, así como requisitos complejos para la capacitación del personal, la vivienda y el cuidado de animales, y el cumplimiento de las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). También limita los tipos de compuestos que se pueden entregar a los mosquitos, lo que limita los estudios que se pueden llevar a cabo17.
Los aparatos artificiales de alimentación sanguínea, que normalmente utilizan un sistema de membrana para simular la piel huésped, son herramientas útiles para estudiar comportamientos de alimentación sanguínea que eluden la necesidad de mantenimiento de los huéspedes vivos. Sangre entera se puede comprar a un número de proveedores y alimentado a mosquitos utilizando calentado, alimentadores de membrana artificial con chaqueta de agua o dispositivos similares18,19. En este protocolo, demostramos el uso de pequeños alimentadores de membrana desechables denominados "Glytubes". Este alimentador de membranas, publicado previamente por Costa-da-Silva et al. (2013)20, se puede ensamblar fácilmente desde equipos de laboratorio estándar, por lo que es ideal para entregar comidas de sangre a un número moderado de mosquitos y fácil de escalar para probar grupos más grandes o formulaciones de múltiples comidas. El Glytube es una alternativa barata y eficiente a otros alimentadores artificiales comerciales, que pueden requerir mayores volúmenes de comidas y son más adecuados para alimentar por lotes a grandes grupos de mosquitos en una sola formulación de comida21.
Este protocolo incluye dos secciones: preparación/entrega de comidas artificiales y cuantificación del consumo. En la primera sección, los Glytubes se utilizan como un medio eficiente para ofrecer dietas manipuladas. La sangre entera puede sustituirse por una comida totalmente artificial para comparar los efectos de los sustitutos de la sangre en lugar de una comida de sangre. Aquí se presenta una receta adaptada de Kogan (1990)22, aunque se han desarrollado múltiples formulaciones de comidas artificiales23,24. Además, la alimentación es un método menos invasivo y menos laborioso para introducir compuestos farmacológicos que la inyección. Debido al bajo volumen total requerido para cada comida (1-2 ml), este protocolo proporciona un método de entrega atractivo para reducir las cantidades de reactivos caros. Ae. aegypti las hembras consumen fácilmente comidas sin proteínas de solución salina con adenosina 5′-tripfosfato (ATP)25,26, que proporciona una línea de base para medir los efectos de los componentes de una sola comida. Por ejemplo, Neuropeptide Y-like receptor 7 (NPYLR7) en Ae. aegypti es conocido por mediar en la supresión de la búsqueda del huésped después de una comida de sangre rica en proteínas, y cuando npylr7 agonistas se añaden a una comida salina libre de proteínas, los mosquitos hembra exhiben supresión de búsqueda de huésped similar a los que han consumido sangre entera7.
En la segunda sección, se presentan pasos para cuantificar el volumen de cada comida consumida por un mosquito hembra individual. Este ensayo se basa en la fluorescencia y captura el estado de alimentación en una resolución más alta que los métodos en los que las hembras se clasifican como "alimentadas" o "no alimentadas" basándose solo en la evaluación visual de la distensión abdominal. Al añadir fluoresceína a la comida antes de la alimentación, los volúmenes de comidas ingeridos por individuos pueden cuantificarse homogeneizando cada mosquito en un plato de 96 pozos y midiendo la intensidad de la fluorescencia como lectura. Este ensayo puede medir las diferencias en la alimentación del vigor en respuesta a variables como la composición de las comidas o el trasfondo genético de los mosquitos. La cuantificación precisa es fundamental para los tamaños intermedios de las comidas, por ejemplo, cuando a las hembras se les ofrecen comidas subóptimas que contienen disuasivos de alimentación o cuando consumen comidas de sacarosa de tamaños variables27. Si se requieren mosquitos alimentados para ensayos conductuales posteriores después de la cuantificación del tamaño de las comidas, el tamaño de las comidas se puede calcular sopesando a las hembras anestesiadas en grupos y estimando el aumento promedio de la masa por individuo. Aunque es menos preciso que el marcado de fluoresceína, el pesaje todavía proporciona una estimación agregada del volumen de las comidas y permite examinar el efecto de la comida en los procesos aguas abajo, como la fecundidad o la posterior atracción del huésped. Mientras que el tamaño de las comidas en la sangre es variable y puede ser influenciado por una miríada de factores11,28,29,tamaños de comida ingeridos medidos con los métodos descritos aquí son consistentes con las cuantificaciones anteriores7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Las hembras de ciertas especies de mosquitos pueden propagar enfermedades mientras pican a los huéspedes de vertebrados para obtener las comidas de sangre ricas en proteínas necesarias para el desarrollo de óvulos. En el laboratorio, los investigadores pueden entregar comidas de sangre artificiales y derivadas de animales a mosquitos a través de alimentadores de membrana, que permiten la manipulación de la composición de las comidas. Aquí, presentamos métodos para alimentar la sangre y las comidas artificiales de sangre a los mosquitos Aedes aegypti y cuantificar el volumen consumido por las hembras individuales.
La alimentación dirigida y la cuantificación de las comidas artificiales/sanguíneas tienen un uso amplio, incluyendo la prueba de los efectos de los componentes de las comidas en el comportamiento y la fisiología de los mosquitos, la entrega de compuestos farmacológicos sin inyección e la infectación de mosquitos con patógenos específicos. La adición de tinte de fluoresceína a la comida antes de la alimentación permite una cuantificación posterior del tamaño de la comida. El volumen de comidas consumido por los mosquitos se puede medir ya sea en peso, si las hembras deben utilizarse más adelante para experimentos conductuales, o homogeneizando hembras individuales en placas de 96 pozos y midiendo los niveles de fluorescencia utilizando un lector de placas como ensayo de punto final. La cuantificación del tamaño de la comida se puede utilizar para determinar si el cambio de los componentes de la comida altera el volumen de comida ingerido o si el consumo de comida difiere entre las cepas de mosquitos. La cuantificación precisa del tamaño de las comidas también es fundamental para los ensayos posteriores, como los efectos de medición en la atracción del huésped o la fecundidad. Los métodos presentados aquí se pueden adaptar aún más para realizar un seguimiento de la digestión de las comidas en el transcurso de los días o para incluir múltiples marcadores distintivos añadidos a diferentes comidas (como el néctar y la sangre) para cuantificar el consumo de cada comida por un solo mosquito.
Estos métodos permiten a los investigadores realizar mediciones de alto rendimiento de forma individual para comparar el volumen de comidas consumido por cientos de mosquitos individuales. Por lo tanto, estas herramientas serán ampliamente útiles para la comunidad de investigadores de mosquitos para responder a diversas preguntas biológicas.

La Figura 1 presenta un esquema para ensamblar el Glytube, mientras que la Figura 2 muestra una visión general del diseño experimental para medir el tamaño de las comidas utilizando el ensayo basado en fluorescencia descrito aquí. La Figura 3 proporciona mediciones representativas del tamaño de las comidas de fluoresceína de un experimento de alimentación en sangre. La Figura 4, la Figura 5y la Figura 6 ilustran una muestra de preguntas biológicas que se pueden abordar mediante este protocolo. Las aplicaciones del protocolo son amplias e incluyen alterar la composición de las comidas en la sangre, alimentar compuestos farmacológicos, cuantificar con precisión comidas de sangre sub-óptimas o comidas de néctar más pequeñas, y comparar el comportamiento de alimentación entre los genotipos de mosquitos.
Para generar una curva estándar para los cálculos del volumen de comidas, las lecturas de fluorescencia se trazan a partir de los pozos de referencia designados que contienen cada uno un mosquito sin engendrada y un volumen conocido de la comida con 0,002% fluoresceína(Figura 3A). Las lecturas de fluorescencia de los pozos restantes, que contienen mosquitos del grupo de control negativo de mosquitos no sefados o del grupo experimental de mosquitos que ofrecen una comida, se comparan con esta curva estándar para cuantificar el volumen de comida (μL) consumido por cada mosquito(Figura 3B). Para validar las lecturas basales en este ensayo, debe confirmarse que a los mosquitos del grupo de control negativo no controlado no se les asigna un valor positivo de μL consumido (Figura 3B, izquierda). Aunque a todas las hembras del grupo experimental se les ofreció la harina de sangre, algunos mosquitos alimentados(Figura 3B, medio)y otros no(Figura 3B, derecha). Este resultado demuestra que se pueden obtener dos tipos de datos de este protocolo: 1) el porcentaje de hembras totales que se alimentan de una comida determinada, y 2) el volumen ingerido por las hembras que se alimentan de una comida dada.
Este protocolo se puede utilizar para entregar y cuantificar comidas con varias composiciones proteicas. Figura 4A,B mostrar datos recogidos con comidas con fluoresceína añadida. La proporción de mosquitos que alimentaron y el volumen de comida que ingirieron, respectivamente, se calcularon a partir de las lecturas de fluorescencia. Estas lecturas son altamente sensibles y permiten una cuantificación precisa de μL, pero tienen la limitación de que los mosquitos no pueden ser utilizados para futuros experimentos en vivo. La Figura 4C,D muestra los datos recogidos de un experimento independiente con mosquitos que fueron puntuados como alimentados o no alimentados por los ojos después de que se les ofrecieron comidas sin fluoresceína. El tamaño de la comida se calculó como peso promedio/hembra de grupos de 5 mosquitos. Aunque estas mediciones de peso son menos sensibles que las mediciones de fluorescencia, permiten que las hembras sean recuperadas y utilizadas para una mayor experimentación en vivo. La proporción de mosquitos que se alimentan puede variar a través de diferentes días experimentales, como se refleja en la Figura 4A y la Figura 4C.
La Figura 5 muestra el volumen consumido de comidas que contienen medicamentos que regulan el comportamiento de búsqueda de mosquitos. En estos experimentos, a las hembras se les ofreció sangre, solución salina + ATP, o salina + comidas ATP con 100 μM del agonista receptor humano NPY Y2, TM30338. Este medicamento altera el comportamiento de búsqueda de host a través de la activación de Ae. aegypti NPY-like receptor 7. Medir el tamaño de las comidas es fundamental para la interpretación de experimentos para evaluar el efecto de este fármaco en el comportamiento posterior a la alimentación de la sangre, ya que permite al investigador calcular la dosis consumida por cada hembra.
En los ejemplos anteriores, las hembras eran alimentadas con sangre o comidas de sangre sustitutivas, todas las cuales resultaron en comidas de 3-5 μL(Figura 3, Figura 4, Figura 5). Este ensayo basado en fluorescencia también se puede utilizar para medir tamaños de comida más pequeños y/o variables que no se pueden discernir con precisión de las mediciones de peso promedio del grupo. En la Figura 6,se utilizó el mismo protocolo de cuantificación de fluorescencia para medir el comportamiento de alimentación de néctar intercambiando el Glytube por una bola de algodón saturada con 10% sacarosa que contiene 0,002% fluoresceína. Los azúcares de néctar no se pueden presentar en el ensayo de Glytube porque las hembras no pueden detectar la presencia de azúcares de néctar con la stylet y no inician la alimentación27. Estos datos permiten al investigador determinar que las comidas azucaradas son consistentemente más pequeñas que las comidas en la sangre, de acuerdo con el trabajo anterior34 (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Figura 1: Configuración del método Glytube utilizado para alimentar las comidas a los mosquitos. (A) Esquema de un Glytube deconstruido utilizado para alimentar sangre y otras comidas a los mosquitos. (B) Esquema de un Glytube presentado en lo alto de un recipiente de mosquitos con una tapa de malla. Los mosquitos hembra pueden atravesar la tapa de malla para alimentarse. (C) Fotografías del Glytube (arriba), y mosquitos hembra Aedes aegypti antes, durante y después de la alimentación (abajo, de izquierda a derecha) en una comida entregada por Glytube. Se muestra a los mosquitos perforando a través de la malla que cubre su recipiente para acceder al alimentador de membranas. (D) Fotografías que muestran la aparición de mosquitos Ae. aegypti hembras que no están alimentados (izquierda) y que se han engordado en una comida de sangre artificial (derecha, arriba) o una comida salina + ATP (derecha, abajo). El método Glytube fue publicado previamente en Costa-da-Silva et al. (2013)20. Las fotografías en (C) y (D) son cortesía de Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Figura 2: Esquema de cómo cuantificar el tamaño de las comidas después del protocolo de alimentación sanguínea de Glytube. (A) A los mosquitos se les ofrece una comida con fluoresceína (parte superior, grupo experimental) o ninguna comida (inferior, grupo de control negativo no alimentado). (B) Los mosquitos individuales se añaden a una placa de 96 pozos después de terminar el experimento de alimentación. (C) La curva estándar se genera utilizando cantidades conocidas de comida que contienen 0.002% fluoresceína. (D) Los mosquitos son homogeneizados para liberar cualquier fluoresceína consumida, y los niveles de fluorescencia en cada pozo se cuantifican utilizando un lector de placas. Este método de cuantificación de fluorescencia se modifica desde Liesch et al. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Figura 3: Experimento de alimentación sanguínea de Glytube con cuantificación basada en fluoresceína. (A) Mediciones de curva estándar obtenidas de los pozos donde se añadió un mosquito del grupo de control no controlado a una cantidad conocida de comida que contenía 0,002% fluoresceína (escala del eje y = unidades arbitrarias). B) Volumen de comida calculado con lecturas de fluorescencia para hembras en el grupo de control no alimentado (izquierda, negro, n = 40), el grupo experimental que se alimentaba de sangre (medio, rojo, n = 37), y el grupo experimental que no se alimentaba de sangre (derecha, rojo, n = 23). Cada punto representa una medida de una hembra individual. Los datos se muestran como mediana con rango. Las letras indican grupos estadísticamente distintos, prueba Kruskal-Wallis con la comparación múltiple de Dunn, p<0.01. Estos datos se publicaron en Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Figura 4: Cuantificación de comidas con diferente composición proteica. A las hembras se les ofrecieron comidas de sangre de oveja (roja), sangre artificial con proteínas de sangre humana (Kogan (1990)22) (naranja), o solución salina sin proteínas + comida ATP (aqua)7. (A) Porcentaje de hembras alimentadas con lecturas de fluorescencia. Cada punto representa un grupo de 12–16 mujeres. Los datos se muestran como medianas con rangos, n = 12. B) Volumen de comida calculado con lecturas de fluorescencia. Cada punto representa una medida de una hembra individual en un solo ensayo de la Figura 4A. Los datos se muestran como medianas con rangos, n = 12. (C) Porcentaje de hembras completamente engordadas después de la alimentación por membrana artificial, puntuada por ojo. Cada punto representa el porcentaje de mujeres que provienen de grupos de 20-30 mujeres. Los datos se muestran como medianas con rangos, n = 23. (D) Los tamaños de las comidas puntuadas como peso/hembra después de la condición de alimentación se puntuó por ojo. Los pesos se calcularon como el promedio de grupos de 5 mosquitos. Los datos se muestran como medianas con rangos, n = 23. R–D: Las letras indican grupos estadísticamente distintos, prueba Kruskal-Wallis con la comparación múltiple de Dunn, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Figura 5: Cuantificación de comidas con compuestos farmacológicos. Las hembras consumen comidas del mismo tamaño de sangre de oveja (rojo), solución salina + ATP (agua) y solución salina + ATP + 100 μM dosis de receptor humano NPY Y2 agonista TM30338 (azul oscuro). Volumen de comida calculado con lecturas de fluorescencia. Cada punto representa una medida de una hembra individual. Los datos se muestran como medianas con rangos, n = 12. Las letras indican grupos estadísticamente distintos, prueba Kruskal-Wallis con la comparación múltiple de Dunn, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Figura 6: Cuantificación de comidas de néctar más pequeñas. (A) Esquema del ensayo de alimentación de néctar. B) El volumen de comida calculado con lecturas de fluorescencia para hembras de tipo salvaje ofrecía comidas de agua (azul, n = 36) o 10% sacarosa (verde, n = 53), cada una con 0,002% fluoresceína, en el ensayo de alimentación de néctar. Cada punto representa una medida de una hembra individual. Los datos se muestran como medianas con rangos. Las cartas indican grupos estadísticamente distintos, prueba Mann-Whitney, p<0.05. Estos datos se publicaron en Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Harina de sangre artificial</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentración de solución de stock (mg/ml)</td>
			<td>Volumen de solución de stock en harina (μL/ml)</td>
			<td>Concentración final de la comida (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Componentes proteicos*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globulins</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemoglobina</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albúmina</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteína total</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Componentes no proteicos</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentración de solución de stock (mM)</td>
			<td>Volumen de solución de stock en harina (μL/ml)</td>
			<td>Concentración final de comidas (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>En stock de γ globulina</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>En stock de γ globulina</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Los componentes proteicos se preparan en solución de stock de agua de doble destilado, a excepción de γ-Globulinas, que se disuelven en 400 mM NaHCO3 e incluyen una cantidad variable de NaCl (2-4%) en el producto.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Receta para preparar comidas artificiales de sangre (adaptadas de Kogan (1990)22). La sangre artificial consiste en proteínas y componentes no proteicos que se encuentran regularmente en la sangre humana y proporciona la opción de variar las proporciones de estos componentes. Los mosquitos pueden producir huevos después de alimentarse con sangre artificial7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Comida salina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Concentración de solución de stock (mM)</td>
			<td>Volumen de solución de stock en harina (μL/ml)</td>
			<td>Concentración final de comidas (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Receta para comida salina con ATP (adaptada de Duvall et al. (2019)7). Las comidas salinas sin proteínas se pueden utilizar para entregar compuestos de interés a los mosquitos mientras todavía imitan la distensión abdominal que ocurre después de la alimentación en la sangre, pero sin desencadenar el desarrollo del huevo que ocurre cuando las proteínas se ingiere.

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

El objetivo de este protocolo es entregar comidas de sangre artificiales y derivadas de animales a los mosquitos Aedes aegypti a través de un alimentador de membrana artificial y cuantificar con precisión el volumen de comida ingerida.

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.6K vistas.  The Rockefeller University. El objetivo de este protocolo es entregar comidas de sangre artificiales y derivadas de animales a los mosquitos Aedes aegypti a través de un alimentador de membrana artificial y cuantificar con precisión el volumen de comida ingerida.

Video: Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación en los cromosomas mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Methods Article

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti