ニプン・バスル、アドリアナ・K・ロサス・ヴィルガス、ナダフ・シャイ、トレバー・ソレルズの原稿に関するコメント、中陰ゴングとカイロロス・バルソウムの技術支援に感謝します。 図1で使用されている写真を撮ってくれたアレックス・ワイルドに感謝します。K.V.はベーリンガー・インゲルハイム・フォンズ博士フェローシップによって支えられていました。V.J.はNIH T32-MH095246の一部でサポートされました。この研究の一環として、ハワード・ヒューズ医学研究所からジェームズ・H・ギリアム・フェローシップ・フォー・アドバンスト・スタディ・プログラムを通じてロックフェラー大学への助成金がV.J.に支えられた。この資料は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの助成No.の支援を受けた作業に基づいています。NSF DGE-1325261 から V.J.この資料に記載されている意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

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著者らは開示するものは何もない。

多くの実験室の適用のために、人工膜フィーダーは研究者が直接食事の内容を操作する機能を可能にすることによって生きているホストと比較して明確な利点を提供する。人工膜送出には複数の方法が用意されていますが、ここで説明する方法は柔軟性、コスト、スループットの利点があります。他の市販の膜フィーダーと比較して、Glytubeアッセイは、必要な総容積を7、35に抑えることによって、薬物または病原体を含む高価な試薬のための効率的な送達メカニズムを作る、少量の食事量を必要とする。タンパク質フリーの生理食糸と人工血液の食事の両方がエングレーギンメントを促進するので、化合物または病原体は、注射に対するハイスループットおよび非侵襲的な代替手段として、食事に加えることができる。さらに、Glytubeの各成分は、容易に洗浄、交換、またはスケールアップすることができ、給餌装置の交差汚染なしに複数の食事タイプを提供および定量化することができます。
蚊が消費する食事量を定量化するために、蛍光ベースの方法は、摂食の前後に蚊の重量を量るよりも、より正確な食事サイズの定量を可能にする。なお、この方法は終点アッセイである。対照的に、計量は蚊がさらなる実験のために生き続けることを可能にする。プレートリーダーを使用することにより、蛍光ベースの方法を簡単にスケールアップして、何百人もの女性が消費する食事のハイスループット定量化を行うことができます。
高い給餌率を達成するには、女性のホストシーク行動を活性化し、フィーダーに女性を引き付けるのに十分なホストキューが存在する必要があります。蚊がグリチューブの下に混雑していない場合、食事が適切に温められていないか、CO2 の配達が十分でない可能性があります。膜表面に人臭を加えると、人工膜の魅力が確実に高まります。グリチューブの下で蚊が観察されるが、餌を与えることができない場合、食事の組成に欠陥がある可能性があります。女性は、食事自体が暖かくなければ、血液が古すぎる、または食事への添加物が本質的に回避的であるか、または望ましくない化学反応36を引き起こす場合、餌を与えないかもしれない。追加のATPも確実に供給速度を増加させ、提供される各レシピの2 mMの最終濃度にスケールアップすることができる。パラフィルムがGlytubeキャップを横切って引っ張られていない場合、女性は餌を与えることができません。これは女性が効果的に彼女のスタイでパラフィルムを突き刺すことができるのを防ぐので、パラフィルムは均一に透明であるべきであり、バックルすべきではありません。食事がGlytubeを通ってメッシュに漏れた場合、パラフィルムはストレッチプロセス中に破れた可能性があり、交換する必要があります。
食事の組成を変更すると、研究者は、中間腸から食事をクリアするために必要な時間の長さと、その後のホストシーク行動を操作することもできます。ここで提示される食事は、動物由来の血液と同様の消化7 のために24〜36時間を必要とします。これらの食事のいずれかを食べ物を与えた後、女性は消化時間のウィンドウ中に宿主を求めることを抑制します。生理食前の食事にはタンパク質が欠けているため、女性は食事が取り除いた後に宿主を求めて戻ります。より速いリターンが望ましい場合、研究者は約6時間27で排泄される代替の「迅速なクリア」生理食音の食事を選択することができます。ここで提示される生理食塩水の組成は、人工血液食事と直接結果を比較するために一致しているが、"迅速なクリア"食事は、脊椎動物の血液中に見られる生理学的塩分濃度とより密接に一致する。
ここで説明する方法には、研究者の実験目標に最も適したアッセイを選択する前に考慮すべき制限があります。記載されたフルオレセイン測定では、蚊を追加の実験に再び使用することはできません。しかし、体重の測定は、フルオレセインアッセイを用いて食事サイズ定量の前に行うことができる。体重と食事のサイズが特定の食事の複数の試験で一貫している場合、体重は将来の実験で代理として使用することができます。さらに、このプロトコルは、ホストシークと血液供給行動の欠損を区別しません。膜フィーダーを見つけることに障害を示す蚊は、摂食率および/または食事のサイズの減少を持つことになります。アッセイ全体の行動を記録するためにカメラを追加することで、研究者は女性がGlytubeを見つけることができないかどうか、またはGlytubeを見つけるが餌を与えないかどうかを判断することができます。
ここで説明するアッセイは、蚊の摂食行動に関連する多くの顕著な質問を探求するために適応することができる。例えば、特定の血液タンパク質の寄与は、人工血液の食事中の構成タンパク質または総タンパク質濃度の比率を変化させることによって探索することができる。複数の摂食イベントから食事のサイズを評価するために、独特の蛍光スペクトルを有する色素を添加して、食事を独特の供給源37と区別することができる。このプロトコルはまた、血液を検出し、摂取に使用される内部マウスパーツ(すなわち、stylet)と、蚊が血液供給を開始するために着陸する蚊として接触する化学感覚の付属物(すなわち、陰唇、脚)を個別に刺激するように変更することができる。例えば、リガンドを食事に直接加えた場合、膜はスタイレットによってのみ穿孔されるため、陰素と脚に接触しません。代わりにパラフィルムの外表面にリガンドを添加した場合、それらは食事から分離されたままであり、陰唇と脚36によって接触され得る。最後に、血液供給行動の詳細な運動学はよく理解されておらず、ここで提示される方法は、高解像追跡と機械学習ツールを組み合わせて、移動、姿勢、および摂食ダイナミクス38の行動読み出しを抽出するように変更することができる。
このプロトコルは、蚊の採血と摂食後の行動を研究するために薬理学的および遺伝子操作を採用する研究者にサービスを提供する能力を持つ、ユーザーフレンドリーで費用対効果の高いことを目的としています。

人工膜フィーダーを使用して Aedes aegypti 蚊に修飾された血液食事を供給し、個々の蚊が消費する食事量を正確に測定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、食事の内容を変更したり、蚊の異なる実験群によって消費される食事量を比較するために柔軟に適応することができる。
Ae. aegypti蚊は、黄熱病、デング熱、チクングニア、ジカ1、2、3、4、5などの病気を引き起こす病原体を広めることによって、世界の健康を脅かす。Ae. aegyptiメスは血液供給者を義務付ける。卵の発達に必要なタンパク質を得るために脊椎動物の血液を消費する必要があり、卵の各クラッチは少なくとも1つの宿主6、7、8からの完全な血液の食事を必要とします。メスの蚊は、まず彼女のスタイレットで皮膚を突き刺し、宿主の免疫応答を引き起こす化合物を含む唾液を注入することによって、彼女のホストを噛む9.その後、彼女は彼女のステーレットを通して彼女の中間に血液を送り込んで餌を与えます。感染した宿主から血液の食事を摂取しながら、彼女は血液媒介病原体6、8を摂取し、蚊の中腸から唾液腺10に移動する。この方法で感染した雌の蚊は、その後の宿主11、12を噛むときに唾液と一緒に病原体を注入することによって病気を広めることができる。血液供給行動のメカニズムを理解し、定量化することは、蚊媒介性疾患の伝染を制御する上で重要なステップです。
蚊の飼育と実験のための多くの実験室プロトコルは、マウス、モルモット、またはヒトを含む生きた動物を血液源13、14、15、16として使用する。生きた動物の使用は倫理的な懸念と、人員訓練、動物の住宅とケア、および制度的動物ケア・使用委員会(IACUC)政策の遵守に対する複雑な要件を課しています。また、蚊に送ることができる化合物の種類を制限します,これは、実行することができる研究を制約します 17 .
人工血液供給装置は、通常、宿主の皮膚をシミュレートするために膜システムを使用し、ライブホストの維持の必要性を回避する血液供給行動を研究するための有用なツールである。全血は、ベンダーの数から購入し、加熱された水ジャケット人工膜フィーダーまたは同様のデバイス18、19を使用して蚊に供給することができます。このプロトコルでは、「Glytubes」と呼ばれている小型の使い捨て膜フィーダーの使用を実証する。コスタ・ダ・シルバら(2013)20によって以前に発表されたこの膜フィーダーは、標準的な実験室機器から簡単に組み立てることができ、血液食事を適度な数の蚊に送り込むのに理想的であり、より大きなグループまたは複数の食事製剤をテストするためにスケールアップするのが簡単です。Glytubeは、他の商用人工フィーダーに代わる安価で効率的な代替物であり、食事量が大きい場合があり、単一の食事製剤21上で蚊の大きなグループをバッチ供給するのに適している。
このプロトコルには、人工食事の準備/配達と消費の定量化の2つのセクションが含まれています。最初のセクションでは、Glytubesは、操作された食事を提供するための効率的な手段として使用されています。全血は、血液の代わりに血液置換の効果を比較するために、完全に人工的な食事で置き換えることができます。コーガン(1990)22から適応したレシピがここで提示されていますが、複数の人工食事製剤が23,24に開発されています。さらに、給餌は、注射よりも薬理学的化合物を導入するための侵襲性が低く、手間のかからない方法です。各食事に必要な総容積(1~2 mL)が少ないため、このプロトコルは高価な試薬の量を減らすための魅力的な送達方法を提供します。ae. aegyptiメスは、単一の食事成分の効果を測定するためのベースラインを提供するアデノシン5′三リン酸(ATP)25、26と生理食塩水のタンパク質フリーの食事を容易に消費します。例えば、Ae.aegyptiにおけるニューロペプチドY様受容体7(NPYLR7)は、タンパク質が豊富な血液食事の後に宿主を求める抑制を仲介することが知られており、NPYLR7アゴニストがタンパク質を含まない生理食前の食事に添加されると、雌蚊は全血を消費したものと同様の宿主求めの抑制を示す。
第2のセクションでは、個々のメスの蚊が消費する各食事の量を定量化するためのステップが提示される。このアッセイは蛍光ベースで、腹部の膨満度の視覚的評価に基づいて女性が「供給」または「未供給」に分類される方法よりも高い解像度で摂食状態を捉える。摂食前に食事にフッ素を加えることで、個人が摂取した食事量を96ウェルプレートで均質化し、蛍光強度を読み出しとして測定することで定量化することができます。このアッセイは、食事組成や蚊の遺伝的背景などの変数に応答して、供給活力の違いを測定することができます。正確な定量化は、中間食事のサイズ、例えば女性が摂食抑止力を含む最適でない食事を提供される場合、または可変サイズ27のスクロースミールを消費する場合に重要である。食事サイズの定量化後のその後の行動アッセイに蚊を与える必要がある場合、食事のサイズは、代わりに麻酔薬をグループで計量し、個人あたりの平均増加質量を推定することによって計算することができます。フルオレセインマーキングよりも精度は低いが、計量は依然として食事量の集計推定値を提供し、食事が下流プロセス(例えば、胎児性または後の宿主誘引力)に及ぼす影響を調べることができる。血液の食事のサイズは可変であり、無数の因子11、28、29の影響を受けることができるが、ここで説明する方法で測定された摂取された食事サイズは、以前の定量7、30、31と一致している。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

特定の蚊種のメスは、卵の発達に必要なタンパク質が豊富な血液食事を得るために脊椎動物の宿主を噛みながら病気を広めることができます。実験室では、研究者は、食事組成の操作を可能にする膜フィーダーを介して蚊に動物由来および人工血液食事を提供することができます。ここでは 、Aedes aegypti 蚊に血液および人工血液食事を供給し、個々の女性が消費する量を定量化する方法を提示する。
人工的/血液食事の標的餌と定量化は、食事成分が蚊の行動や生理学に及ぼす影響のテスト、注射なしで薬理学的化合物を提供すること、蚊を特定の病原体に感染させるなど、幅広い用途を持っています。摂食前にフルオレセイン染料を食事に加えることにより、その後の食事サイズの定量が可能になります。蚊が消費する食事量は、体重、後で女性を行動実験に使用する場合、または96ウェルプレートの個々のメスを均質化し、プレートリーダーをエンドポイントアッセイとして使用して蛍光レベルを測定することによって測定することができます。食事サイズの定量化は、食事成分を変更すると摂取される食事量が変化するか、または食事の消費量が蚊の株によって異なるかどうかを決定するために使用することができます。正確な食事サイズの定量は、宿主の魅力や胎児性に対する影響を測定するような下流アッセイにとっても重要です。ここで提示される方法は、日の経過とともに食事の消化を追跡したり、異なる食事(蜜や血液など)に追加された複数の識別可能なマーカーを含むようにして、各食事の消費量を単一の蚊によって定量化するようにさらに適応することができる。
これらの方法により、研究者は単独でハイスループット測定を行い、何百もの個々の蚊が消費する食事量を比較することができます。したがって、これらのツールは、多様な生物学的質問に答えるために蚊の研究者のコミュニティに広く役立ちます。

図1 はGlytubeを組み立てる模式図を示し、図 2 は、ここで説明する蛍光ベースのアッセイを用いて食事サイズを測定する実験計画の概要を示している。 図3 は、血液供給実験からの代表的なフルオレセイン食事サイズ測定を提供する。 図 4、 図 5、および 図 6 は、このプロトコルを使用して対処できる生物学的な質問のサンプルを示しています。プロトコルの用途は広範囲に及び、血液食事組成の変化、薬理学的化合物の摂食、最適でない血液食事または小さな蜜食事の正確な定量化、蚊の遺伝子型にわたる摂食行動の比較が含まれる。
食事量計算のための標準曲線を生成するために、蛍光測定値は、それぞれ0.002%フルオレセインを有する未供給の蚊および既知の食事量を含む指定された基準ウェルからプロットされる(図3A)。残りの井戸からの蛍光測定値は、未収蚊の陰性対照群または食事を提供した蚊の実験群のいずれかから蚊を含み、各蚊が消費する食事量(μL)を定量化するためにこの標準曲線と比較される(図3B)。このアッセイのベースライン測定値を検証するには、未供給の陰性対照群の蚊にμL消費の正の値が割り当てられないことを確認する必要があります(図3B、左)。実験群の全ての女性が血液の食事を提供されたが、一部の蚊は餌を与えた(図3B、中間)、いくつかは食べなかった(図3B、右)。この結果は、このプロトコルから2種類のデータを得ることができることを示しています:1)与えられた食事を食べる女性全体の割合と、2)与えられた食事を食べる女性が摂取した体積。
このプロトコルは、様々なタンパク質組成物を含む食事を送達し、定量化するために使用できます。 図4A,Bは、 フッ素を添加した食事を用いて収集したデータを示す。餌を与えた蚊の割合と摂取した食事量は、それぞれ蛍光測定値から計算した。これらの測定値は非常に感度が高く、μLの正確な定量化が可能ですが、蚊は将来のライブ実験には使用できないという制限があります。 図4C,Dは、 フルオレセインなしで食事を提供された後に、蚊に餌を与えられたり、目で食べられないとスコア付けされた蚊を用いた独立した実験から収集されたデータを示している。食事の大きさは、5匹の蚊の群から平均体重/メスとして計算した。これらの重量測定は蛍光測定よりも感度が低いが、女性を回収し、さらなる生実験に使用することを可能にする。蚊の餌を与える割合は、実験日によって異なる可能性があります( 図 4A および 図 4Cに示すように)。
図5 は、蚊の宿主を求める行動を調節する薬物を含む食事の消費量を示す。これらの実験では、女性は、ヒトNPY Y2受容体アゴニストTM30338の100μMを有する血液、生理食類+ATP、または生理食物+ATP食事を提供した。この薬物は 、Ae. aegypti NPY様受容体7の活性化を通じて宿主を求める行動を変える。食事のサイズを測定することは、研究者が各女性が消費する用量を計算することを可能にするので、この薬物が血液後摂食行動に及ぼす影響を評価する実験の解釈にとって重要である。
前の例では、女性は血液または代替血液の食事を与えられ、その結果、3〜5μLの食事が生まれました(図3、図4、図5)。この蛍光ベースのアッセイは、平均グループ体重測定から正確に識別できない、より小さく、より可変的な食事サイズを測定するためにも使用できます。図6では、0.002%フルオレセインを含む10%スクロースで飽和した綿球に対してGlytubeを交換して蜜送り行動を測定するために、同じ蛍光定量プロトコルを使用した。女性はスタイレットで蜜糖の存在を検出できず、摂食を開始しないため、Glytubeアッセイではネクター糖を提示することはできません。これらのデータにより、研究者は、前の研究34(図6)と一致して、砂糖の食事が血液の食事よりも一貫して小さいことを決定することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> 図1:蚊に食事を与えるために使用されるGlytube法の設定。(A) 蚊に血液やその他の食事を供給するために使用される分解されたGlytubeの模式図。(B) Glytube の模式図は、メッシュの蓋をした蚊の容器の上に提示した。メスの蚊は、餌を与えるためにメッシュ蓋を通して突き刺すことができます。(C)グリチューブ(上)と雌の Aedes aegypti 蚊の写真は、グリチューブが配達した食事の前、中、および後(下、左から右)に餌を与えた後である。蚊は、膜フィーダーにアクセスするために容器を覆うメッシュを通して突き刺さって示されています。(D) 餌を与えず、人工血液の食事(右、上)または生理食費+ATPミール(右、下)のいずれかに夢中になっている雌の Ae.aegypti 蚊の外観を示す写真。Glytube 法は以前にコスタダ・シルバら (2013)20で出版された。写真(C)と(D)はアレックス・ワイルドの礼儀です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> 図2:Glytubeの採血プロトコル後の食事サイズを定量化する方法の概略図。(A)蚊はフルオレセイン(上、実験群)または食事なし(下、未供給の陰性対照群)の食事を提供される。(B)餌付け実験を終了した後、96ウェルプレートに個々の蚊を加える。(C)標準曲線は、0.002%フルオレセインを含む既知の量の食事を使用して生成される。(D) 蚊は、消費された蛍光を放出するために均質化され、各ウェルの蛍光レベルはプレートリーダーを用いて定量化される。この蛍光定量法は、Lieschら(2013)34から修飾される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> 図3:フルオレセインベース定量によるグリチューブ給餌実験(A) 未供給の対照群から得られた、0.002%フルオレセイン(y軸スケール=任意の単位)を含む既知の量の食事に添加された井戸から得られる標準曲線測定。(B)未供給対照群の女性の蛍光測定値(左、黒、n=40)、血液を与えた実験群(中、赤、n=37)、および血液を食べなかった実験群(右、赤、n=23)を用いて計算した食事量。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲を持つ中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループを示し、クリュスカル・ウォリスはダンの多重比較、p<0.01をテストします。これらのデータは、Jovéら(2020)27で公開されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> 図4:タンパク質組成が異なる食事の定量化女性は、羊の血液(赤)、ヒト血液タンパク質を有する人工血液(コーガン(1990)22)(オレンジ)、またはタンパク質フリーの生理食動物+ATPミール(アクア)7のいずれかの食事を提供した。(A) 蛍光測定値を用いて採点された女性の割合。各ポイントは12~16人の女性のグループを表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。(B)蛍光測定値を用いて計算した食事量。各ポイントは、図4Aからの単一の試験における個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。(C) 人工膜供給後に完全に充満した女性の割合は、目で採点される。各ポイントは、20~30人の女性のグループから集まった女性の割合を表します。データは、範囲 n = 23 の中央値として表示されます。(D) 給餌状態が目で採点された後、体重/女性として採点された食事サイズ。体重は5つの蚊の群の平均として計算した。データは、範囲 n = 23 の中央値として表示されます。A–D: 文字は統計的に異なるグループを示し、 Kruskal-Wallis 検定とダンの多重比較、 p<0.05.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> 図5:薬理化合物による食事の定量化メスは、同じ大きさの羊の血液(赤)、生理食い+ ATP(アクア)、および生理食類+ATP + 100 μM用量のヒトNPY Y2受容体アゴニストTM30338(ダークブルー)の食事を消費する。蛍光測定値を用いて計算された食事量。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループを示し、クリュスカル・ウォリスはダンの多重比較、p<0.05をテストします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> 図6:小さい蜜の食事の定量化。(A) 蜜送りアッセイの概略図。(B)野生型メスの蛍光測定値を用いて計算された食事量は、水(青、n=36)または10%スクロース(緑、n=53)の食事を提供し、それぞれ0.002%フルオレセインを含む、蜜供給アッセイで提供した。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲を持つ中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループ、マン・ホイットニー検定、p<0.05を示します。これらのデータは、Jovéら(2020)27で公開されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">人工血液の食事</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック溶液の濃度(mg/mL)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">タンパク質成分*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γグロブリン</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘモグロビン</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>アルブミン</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>総タンパク質</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">非タンパク質成分</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック溶液の濃度(mM)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>γグロブリン在庫で</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナフコ3
</td>
			<td>γグロブリン在庫で</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">※タンパク質成分は、400 mM NaHCO3 に溶解し、可変量のNaCl(2-4%)を含むγグロブリンを除き、二重蒸留水のストック溶液に調製される製品に含まれる。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:人工血液の食事を準備するためのレシピ(コーガン(1990)から適応22)。人工血液は、ヒトの血液中に定期的に見られるタンパク質および非タンパク質成分で構成され、これらの成分の比率を変化させるオプションを提供する。蚊は人工血液7、22を食べた後に卵を作り出すことができます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">生理食いの食事</td>
		</tr>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ストック溶液の濃度(mM)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナフコ3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ATPによる生理食用のレシピ(デュヴァルらから適応(2019)7)。タンパク質フリーの生理食動物の食事は、血液を摂食した後に起こる腹部の膨満を模倣しながら、蚊に関心のある化合物を提供するために使用することができますが、タンパク質を摂取したときに発生する卵の発達を引き起こすことなく。

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

このプロトコルの目標は、人工膜フィーダーを介して Aedes aegypti 蚊に動物由来および人工血液食事を提供し、摂取される食事の量を正確に定量することです。

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.7K ビュー.  The Rockefeller University. このプロトコルの目標は、人工膜フィーダーを介して Aedes aegypti 蚊に動物由来および人工血液食事を提供し、摂取される食事の量を正確に定量することです。

ビデオ: Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

免疫・感染学

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

蚊の機能解析のためのカルシウムの生物発光アッセイ（ネッタイシマカ）とダニ（ Rhipicephalus microplus）Gタンパク質共役受容体

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

蛍光灯<em&gt;その場で</em蚊の分裂期染色体上&gt;ハイブリダイゼーション

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

ライム病研究における送信および外因診断法のために動物にダニの摂食

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).