Wir danken Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai und Trevor Sorrells für die Kommentare zu den Manuskripten und Zhongyan Gong und Kyrollos Barsoum für die technische Unterstützung. Wir danken Alex Wild für die Fotos, die in Abbildung 1verwendet werden. Unterstützt wurde K.V. vom Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship. V.J. wurde teilweise von NIH T32-MH095246 unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium der Rockefeller University vom Howard Hughes Medical Institute durch das James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study Program an V.J. unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unter Grant No. NSF DGE-1325261 zu V.J. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck kommen, sind die des/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Für viele Laboranwendungen bieten künstliche Membran-Feeder deutliche Vorteile im Vergleich zu Live-Hosts, da forschern die Möglichkeit bietet, den Inhalt der Mahlzeit direkt zu manipulieren. Obwohl mehrere Methoden für die künstliche Membranzuführung zur Verfügung stehen, bietet das hier beschriebene Verfahren Vorteile in Den usa, kosten, kostenund durchsatz. Im Vergleich zu anderen kommerziellen Membran-Feedern benötigt der Glytube-Assay ein kleines Mehlvolumen, was ihn zu einem effizienten Abgabemechanismus für kostspielige Reagenzien, einschließlich Medikamente oder Krankheitserreger, macht, indem er das erforderliche Gesamtvolumenvon 7,35minimiert. Da sowohl die proteinfreie, aber auch die künstliche Blutszufuhr die Engorgement fördern, können entweder Verbindungen oder Krankheitserreger als hochdurchsatz- und nicht-invasive Alternative zu Injektionen zu einer Mahlzeit hinzugefügt werden. Darüber hinaus kann jede Komponente des Glytube leicht gewaschen, ersetzt oder skaliert werden, um mehrere Mehlarten ohne Kreuzkontamination des Fütterungsgeräts zu liefern und zu quantifizieren.
Um die von Mücken verbrauchten Mehlmengen zu quantifizieren, ermöglicht die fluoreszenzbasierte Methode eine genauere Quantifizierung der Mehlgröße als das Wiegen der Mücken vor und nach der Fütterung. Es sollte beachtet werden, dass diese Methode ein Endpunkt-Assay ist. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Wiegen, die Mücken für weitere Experimente am Leben zu erhalten. Durch die Verwendung eines Plattenlesers kann die fluoreszenzbasierte Methode leicht für die Quantifizierung von Mahlzeiten mit hohem Durchsatz skaliert werden, die von Hunderten von einzelnen Frauen konsumiert werden.
Um hohe Fütterungsraten zu erreichen, muss eine Kombination von ausreichenden Wirtshinweisen vorhanden sein, um das verhalten der weiblichen Wirtssuche zu aktivieren und Weibchen zum Feeder zu locken. Wenn mückenbehaftet unter der Glytube nicht vergedoren, wird die Mahlzeit möglicherweise nicht richtig erwärmt, oder dieCO2-Zustellung reicht möglicherweise nicht aus. Die Zugabe von menschlichem Geruch zur Membranoberfläche erhöht zuverlässig die Attraktivität der künstlichen Membran. Wenn Mücken unter dem Glytube beobachtet werden, aber nicht füttern, kann die Zusammensetzung des Essens schuld sein. Weibchen dürfen sich nicht ernähren, wenn die Mahlzeit selbst nicht warm ist, das Blut zu alt ist oder wenn die Zusatzstoffe zur Mahlzeit an sich aversiv sind oder eine unerwünschte chemische Reaktion verursachen36. Zusätzliche ATP erhöht auch zuverlässig die Fütterungsraten und kann in jeder der bereitgestellten Rezepturen auf eine Endkonzentration von 2 mM skaliert werden. Weibchen dürfen nicht füttern, wenn der Parafilm nicht straff über die Glytube-Kappe gezogen wird; Der Parafilm sollte gleichmäßig transparent sein und nicht einknicken, da dies verhindert, dass das Weibchen den Parafilm mit ihrem Stylet effektiv durchbohren kann. Wenn die Mahlzeit durch das Glytube auf das Netz austritt, kann der Parafilm während des Dehnprozesses gerissen sein und sollte ersetzt werden.
Eine Änderung der Essenszusammensetzung kann es den Forschern auch ermöglichen, die Zeit, die benötigt wird, um die Mahlzeit vom Mittelgut zu befreien, sowie das anschließende Wirtssuchverhalten zu manipulieren. Die hier vorgestellten Mahlzeiten benötigen 24–36 h für die Verdauung7 ähnlich wie tierisches Blut. Nach der Fütterung von einer dieser Mahlzeiten, Weibchen werden Host-Suche während der Verdauung Zeitfenster unterdrücken. Da es der Salinemahlzeit an Protein fehlt, kehren die Weibchen nach dem Essen zur Wirtssuche zurück. Wenn eine schnellere Rückkehr wünschenswert ist, können die Forscher alternative "Schnellclearing" Saline-Mahlzeiten wählen, die in etwa 6 h27ausgeschieden werden. Während die Zusammensetzung der hier vorgestellten Kochsalzlösung auf einen direkten Vergleich der Ergebnisse mit der künstlichen Blutmahlzeit abgestimmt ist, entspricht die "Schnelllicht"-Mahlzeit den physiologischen Salzwerten im Wirbeltierblut.
Die hier beschriebenen Methoden haben Einschränkungen, die vor der Auswahl des Assays berücksichtigt werden sollten, der am besten zu den experimentellen Zielen des Forschers geeignet ist. Die beschriebenen Fluoresceinmessungen erlauben es nicht, Mücken erneut für zusätzliche Experimente zu verwenden. Gewichtsmessungen können jedoch vor der Quantifizierung der Größe der Mahlzeit mit dem Fluorescein-Test durchgeführt werden. Wenn Gewicht und Größe der Mahlzeit in mehreren Versuchen für eine bestimmte Mahlzeit konsistent sind, kann das Gewicht als Proxy in zukünftigen Experimenten verwendet werden. Darüber hinaus unterscheidet dieses Protokoll nicht zwischen Defiziten bei der Wirtssuche und dem Blutfütterungsverhalten; Mücken, die Bei der Suche nach dem Membranzubringer Beeinträchtigungen aufweisen, haben eine Verringerung der Fütterungsraten und/oder der Essensgröße. Durch hinzufügen einer Kamera, um das Verhalten während des gesamten Assays aufzuzeichnen, können die Forscher feststellen, ob die Weibchen die Glytube nicht finden können, oder ob sie die Glytube finden, aber nicht füttern.
Der hier beschriebene Test kann angepasst werden, um viele offene Fragen im Zusammenhang mit dem Fütterungsverhalten bei Mücken zu untersuchen. Beispielsweise kann der Beitrag bestimmter Blutproteine untersucht werden, indem das Verhältnis von konstituierenden Proteinen oder die Gesamtproteinkonzentration in der künstlichen Blutmahlzeit verändert wird. Um die Größe der Mahlzeiten aus mehreren Fütterungsereignissen zu bewerten, können Farbstoffe mit ausgeprägten Fluoreszenzspektren hinzugefügt werden, um Mahlzeiten von einzigartigen Quellen zu unterscheiden37. Dieses Protokoll kann auch modifiziert werden, um die inneren Mundpartien, die Blut erkennen und die für die Einnahme verwendet werden (d. h. Stylet), und die chemosensorischen Anhängsel, die Haut (d. h. Labium, Beine) als Mückenland, um mit der Blutfütterung zu beginnen, getrennt zu stimulieren36. Wenn z. B. Liganden direkt zur Mahlzeit hinzugefügt werden, treten sie nicht mit dem Labium und den Beinen in Kontakt, da die Membran nur durch den Stylet durchbohrt wird. Wenn stattdessen Liganden zur Außenfläche des Parafilms hinzugefügt werden, bleiben sie von der Mahlzeit getrennt und können durch das Labium und die Beine36kontaktiert werden. Schließlich ist die detaillierte Kinetik des Blutfütterungsverhaltens nicht gut verstanden und die hier vorgestellte Methode könnte modifiziert werden, um hochauflösendes Tracking mit maschinellen Lernwerkzeugen zu kombinieren, um Verhaltensauslesungen von Fortbewegung, Haltung und Fütterungsdynamik zu extrahieren38.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, benutzerfreundlich und kostengünstig zu sein, mit der Fähigkeit, Forschern zu dienen, die pharmakologische und genetische Manipulationen anwenden, um Mückenblutfütterung und Verhalten nach dem Blut zu untersuchen.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Fütterung modifizierter Blutmahlzeiten an Aedes aegypti-Mücken mit einem künstlichen Membran-Feeder und genau zur Messung der Von jeder einzelnen Mücke verbrauchten Mehlmenge. Dieses Protokoll kann flexibel angepasst werden, um den Inhalt der Mahlzeit zu ändern oder die Essensmenge zu vergleichen, die von verschiedenen experimentellen Mückengruppen verbraucht wird.
Die Ae. aegypti Mücke bedroht die globale Gesundheit durch die Verbreitung von Krankheitserregern, die Krankheiten wie Gelbfieber, Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika1,2,3,4,5verursachen. Ae. aegypti Weibchen sind verpflichtete Blutfütterer; Sie müssen Wirbeltierblut konsumieren, um das notwendige Protein für die Eientwicklung zu erhalten, und jede Gemengelage von Eiern erfordert eine vollblutende Mahlzeit von mindestens einem Wirt6,7,8. Die weibliche Mücke beißt zuerst ihren Wirt, indem sie die Haut mit ihrem Stylet durchbohrt und Speichel injiziert, der Verbindungen enthält, die die Immunantwort des Wirts auslösen9. Sie ernährt sich dann, indem sie Blut durch ihren Stylet in ihr Mittelgut pumpt. Während sie eine Blutmahlzeit von einem infizierten Wirt konsumiert, kann sie blutübertragene Krankheitserreger6,8, die dann vom Mittelgut der Mücke zu ihren Speicheldrüsen wandern10. Weibliche Mücken, die auf diese Weise infiziert sind, können Krankheiten verbreiten, indem sie Krankheitserreger zusammen mit Speichel injizieren, wenn sie nachfolgende Wirte beißen11,12. Das Verständnis und die Quantifizierung der Mechanismen des Blutfütterungsverhaltens sind entscheidende Schritte bei der Kontrolle der Übertragung von durch Mücken übertragenen Krankheiten.
Viele Laborprotokolle für Diekundung und Experimente verwenden lebende Tiere wie Mäuse, Meerschweinchen oder Menschen als Blutquelle13,14,15,16. Die Verwendung lebender Tiere stellt ethische Bedenken sowie komplexe Anforderungen an die Ausbildung von Personal, die Unterbringung und Pflege von Tieren sowie die Einhaltung der Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Es begrenzt auch die Arten von Verbindungen, die an Mücken geliefert werden können, was die Studien einschränkt, die durchgeführt werden können17.
Künstliche Blutfütterungsgeräte, die in der Regel ein Membransystem verwenden, um die Wirtshaut zu simulieren, sind nützliche Werkzeuge zur Untersuchung von Blutfütterungsverhalten, die die Notwendigkeit der Aufrechterhaltung von lebenden Wirten umgehen. Vollblut kann von einer Reihe von Anbietern gekauft und mit beheizten, wasserummantelten künstlichen Membran-Feedern oder ähnlichen Geräten18,19an Mücken verfüttert werden. In diesem Protokoll zeigen wir die Verwendung von kleinen, Einweg-Membran-Feedern, die als "Glytubes" bezeichnet werden. Dieser Membran-Feeder, der zuvor von Costa-da-Silva et al. (2013)20veröffentlicht wurde, kann einfach aus Standard-Laborgeräten zusammengesetzt werden, was ihn ideal für die Lieferung von Blutmahlzeiten an eine moderate Anzahl von Mücken macht und einfach für die Prüfung größerer Gruppen oder mehrerer Mahlzeitenformulierungen skaliert werden kann. Die Glytube ist eine kostengünstige und effiziente Alternative zu anderen kommerziellen künstlichen Feedern, die größere Mehlmengen erfordern können und besser geeignet sind, große Mückengruppen auf einer einzigen Mahlzeit formulierung zu füttern21.
Dieses Protokoll umfasst zwei Abschnitte: Zubereitung/Lieferung künstlicher Mahlzeiten und Quantifizierung des Verbrauchs. Im ersten Abschnitt werden Glytubes als effizientes Mittel zur Bereitstellung manipulierter Diäten eingesetzt. Vollblut kann durch eine vollständig künstliche Mahlzeit ersetzt werden, um die Wirkung von Blutersatzstoffen anstelle einer Blutmahlzeit zu vergleichen. Ein Rezept von Kogan (1990)22 wird hier vorgestellt, obwohl mehrere künstliche Mahlzeit Formulierungen entwickelt wurden23,24. Darüber hinaus ist die Fütterung eine weniger invasive und weniger mühsame Methode, um pharmakologische Verbindungen einzuführen als Injektion. Aufgrund des geringen Gesamtvolumens für jede Mahlzeit (1–2 ml) bietet dieses Protokoll eine attraktive Liefermethode, um die Mengen an teuren Reagenzien zu reduzieren. Ae. aegypti Weibchen konsumieren leicht proteinfreie Mahlzeiten von Salinlösung mit Adenosin 5-Triphosphat (ATP)25,26, die eine Grundlage für die Messung der Auswirkungen von einzelnen Mahlzeiten Komponenten bietet. Zum Beispiel, Neuropeptid Y-like-Rezeptor 7 (NPYLR7) in Ae. aegypti ist dafür bekannt, Wirtssuche Unterdrückung nach einer proteinreichen Blutmahlzeit zu vermitteln, und wenn NPYLR7-Agonisten zu einer proteinfreien Herz-Darm-Mahlzeit hinzugefügt werden, zeigen weibliche Mücken Host-Seeking-Unterdrückung ähnlich denen, die Vollblut konsumiert haben7.
Im zweiten Abschnitt werden Schritte zur Quantifizierung des Volumens jeder Mahlzeit vorgestellt, die von einer einzelnen weiblichen Mücke verzehrt wird. Dieser Test ist fluoreszenzbasiert und erfasst den Fütterungsstatus in einer höheren Auflösung als Methoden, bei denen Frauen als "gefüttert" oder "ungefüttert" eingestuft werden, basierend auf einer visuellen Beurteilung der Abdominaldistension allein. Durch Zugabe von Fluorescein in die Mahlzeit vor der Fütterung können die von Einzelpersonen aufgenommenen Mehlmengen quantifiziert werden, indem jede Mücke in einer 96-Well-Platte homogenisiert und die Fluoreszenzintensität als Auslese gemessen wird. Dieser Test kann Unterschiede in der Fütterungskraft als Reaktion auf Variablen wie die Zusammensetzung des Mehls oder den genetischen Hintergrund der Mücken messen. Eine genaue Quantifizierung ist entscheidend für die mittleren Mahlzeitengrößen, z. B. wenn Frauen suboptimale Mahlzeiten angeboten werden, die Fütterungsabschreckung enthalten, oder wenn sie Saccharosemahlzeiten in variablen Größen27konsumieren. Wenn gefütterte Mücken für nachfolgende Verhaltenstests nach der Quantifizierung der Mahlzeitgröße benötigt werden, kann die Essensgröße stattdessen berechnet werden, indem anästhesierte Weibchen in Gruppen gewogen und die durchschnittliche erhöhte Masse pro Individuum geschätzt wird. Obwohl weniger präzise als die Fluorescein-Kennzeichnung, liefert das Wiegen immer noch eine aggregierte Schätzung des Mehlvolumens und ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Mahlzeit auf nachgelagerte Prozesse, wie Z. B. Fruchtbarkeit oder nachfolgende Wirtsattraktion. Während die Größe der Blutmahlzeit variabel ist und durch eine Vielzahl von Faktoren11,28,29beeinflusst werden kann, stimmen die hier beschriebenen Methoden mit den hier beschriebenen Methoden überein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Weibchen bestimmter Mückenarten können Krankheiten verbreiten, während sie Wirbeltierwirte beißen, um proteinreiche Blutmahlzeiten zu erhalten, die für die Eientwicklung erforderlich sind. Im Labor können Forscher über Membranfeeder tierisch abgeleitete und künstliche Blutmahlzeiten an Mücken liefern, die eine Manipulation der Mehlzusammensetzung ermöglichen. Hier stellen wir Methoden zur Fütterung von Blut- und künstlichen Blutmahlzeiten an Aedes aegypti-Mücken vor und quantifizieren das Volumen, das von einzelnen Weibchen konsumiert wird.
Gezielte Fütterung und Quantifizierung von künstlichen/blutenden Mahlzeiten haben breite Verwendungsmöglichkeiten, einschließlich der Prüfung der Auswirkungen von Mehlbestandteilen auf das Verhalten und die Physiologie von Mücken, die Lieferung pharmakologischer Verbindungen ohne Injektion und die Infektion von Mücken mit spezifischen Krankheitserregern. Die Zugabe von Fluoresceinfarbstoff zur Mahlzeit vor der Fütterung ermöglicht eine anschließende Quantifizierung der Mehlgröße. Die von Mücken verbrauchte Mehlmenge kann entweder nach Gewicht gemessen werden, wenn die Weibchen später für Verhaltensexperimente verwendet werden sollen, oder durch Homogenisierung einzelner Weibchen in 96-Well-Platten und Messung von Fluoreszenzspiegeln mit einem Plattenleser als Endpunkttest. Die Quantifizierung der Mehlgröße kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Änderung der Mahlzeitenbestandteile das aufgenommene Essensvolumen verändert oder ob sich der Verzehr von Mehl zwischen Mückenstämmen unterscheidet. Eine genaue Quantifizierung der Größe von Mahlzeiten ist auch für nachgelagerte Assays von entscheidender Bedeutung, z. B. bei der Messung von Auswirkungen auf die Wirtsattraktion oder Fruchtbarkeit. Die hier vorgestellten Methoden können weiter angepasst werden, um die Mahlzeitenverdauung im Laufe der Tage zu verfolgen oder mehrere unterscheidbare Marker, die verschiedenen Mahlzeiten (wie Nektar und Blut) hinzugefügt werden, um den Verzehr jeder Mahlzeit durch eine einzelne Mücke zu quantifizieren.
Diese Methoden ermöglichen es Forschern, im Alleingang Messungen mit hohem Durchsatz durchzuführen, um das von Hunderten von einzelnen Mücken verbrauchte Mehlvolumen zu vergleichen. Diese Instrumente werden daher für die Gemeinschaft der Mückenforscher im Großen und Ganzen nützlich sein, um verschiedene biologische Fragen zu beantworten.

Abbildung 1 zeigt einen Schaltplan für die Montage der Glytube, während Abbildung 2 einen Überblick über das experimentelle Design zur Messung der Mehlgröße anhand des hier beschriebenen fluoreszenzbasierten Assays zeigt. Abbildung 3 enthält repräsentative Fluorescein-Messung der Größe von Fluorescein-Mahlzeiten aus einem Blutfütterungsexperiment. Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6 veranschaulichen eine Stichprobe biologischer Fragen, die mit diesem Protokoll behandelt werden können. Die Anwendung des Protokolls ist breit gefächert und umfasst die Veränderung der Zusammensetzung der Blutmahlzeiten, die Fütterung pharmakologischer Verbindungen, die präzise Quantifizierung suboptimaler Blutmahlzeiten oder kleinerer Nektarmahlzeiten und den Vergleich des Fütterungsverhaltens zwischen Mückengenotypen.
Um eine Standardkurve für Berechnung des Mahlvolumens zu erzeugen, werden Fluoreszenzwerte aus den ausgewiesenen Referenzbrunnen dargestellt, die jeweils eine ungeertete Mücke und ein bekanntes Volumen der Mahlzeit mit 0,002 % Fluorescein enthalten (Abbildung 3A). Fluoreszenzwerte aus den verbleibenden Brunnen, die Mücken entweder aus der negativ kontrollierten Gruppe der ungeernährten Mücken oder der experimentellen Gruppe von Mücken enthalten, die eine Mahlzeit angeboten haben, werden mit dieser Standardkurve verglichen, um das von jeder Mücke verbrauchte Mehlvolumen (L) zu quantifizieren(Abbildung 3B). Um die Ausgangswerte in diesem Test zu validieren, sollte bestätigt werden, dass Mücken aus der nicht gefütterten negativen Kontrollgruppe kein positiver Wert von -L verbraucht wird (Abbildung 3B, links). Obwohl allen Weibchen in der Versuchsgruppe die Blutmahlzeit angeboten wurde, fütterten einige Mücken (Abbildung 3B, Mitte) und einige nicht (Abbildung 3B, rechts). Dieses Ergebnis zeigt, dass aus diesem Protokoll zwei Arten von Daten gewonnen werden können: 1) der Prozentsatz der Weiblichen, die sich von einer bestimmten Mahlzeit ernähren, und 2) das Volumen, das von den Weibchen aufgenommen wird, die sich von einer bestimmten Mahlzeit ernähren.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Mahlzeiten mit verschiedenen Proteinzusammensetzungen zu liefern und zu quantifizieren. Abbildung 4A,B zeigt Daten, die mit Mahlzeiten mit zugesetztem Fluorescein erhoben wurden. Der Anteil der gefütterten Mücken und das von ihnen aufgenommene Essensvolumen wurden aus den Fluoreszenzwerten berechnet. Diese Messwerte sind hochsensibel und ermöglichen eine präzise Quantifizierung von L, haben aber die Einschränkung, dass Mücken nicht für zukünftige Live-Experimente verwendet werden können. Abbildung 4C,D zeigt Daten aus einem unabhängigen Experiment mit Mücken, die nach dem Angebot von Mahlzeiten ohne Fluorescein als gefüttert oder nicht vom Auge gefüttert wurden. Die Essensgröße wurde als Durchschnittsgewicht/Weiblich aus Gruppen von 5 Mücken berechnet. Obwohl diese Gewichtsmessungen weniger empfindlich sind als Fluoreszenzmessungen, ermöglichen sie es, die Weibchen zu bergen und für weitere Live-Experimente zu verwenden. Der Anteil der Mücken, die sich ernähren, kann je nach Versuchstag variieren, wie abbildung 4A und Abbildung 4Cwiderspiegeln.
Abbildung 5 zeigt das Volumen der Mahlzeiten, die Medikamente enthalten, die das Verhalten des Mückenwirts regulieren. In diesen Experimenten wurden Den Weibchen Blut-, Saline- + ATP- oder Saline- + ATP-Mahlzeiten mit 100 M des menschlichen NPY Y2-Rezeptor-Agonisten TM30338 angeboten. Dieses Medikament verändert das wirtsuchende Verhalten durch Aktivierung von Ae. aegypti NPY-ähnliche Rezeptor 7. Die Messung der Essensgrößen ist entscheidend für die Interpretation von Experimenten, um die Wirkung dieses Medikaments auf das Verhalten nach dem Blutzuführen zu bewerten, da es dem Forscher ermöglicht, die von jedem Weibchen verbrauchte Dosis zu berechnen.
In den vorherigen Beispielen wurden Frauen entweder mit Blut oder Ersatzblutmahlzeiten gefüttert, die alle zu 3–5 L-Mahlzeiten führten(Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5). Dieser fluoreszenzbasierte Assay kann auch verwendet werden, um kleinere und/oder variablere Mehlgrößen zu messen, die nicht genau von den durchschnittlichen Gruppengewichtsmessungen zu unterscheiden sind. In Abbildung 6wurde das gleiche Fluoreszenzquantifizierungsprotokoll verwendet, um das Nektar-Fütterungsverhalten zu messen, indem das Glytube gegen eine mit 10 % Saccharose gesättigte Baumwollkugel mit 0,002% Fluorescein ausgetauscht wurde. Nektarzucker können nicht im Glytube-Test präsentiert werden, da Weibchen das Vorhandensein von Nektarzuckern mit dem Stylet nicht erkennen und keine Fütterung initiieren27. Diese Daten ermöglichen es dem Forscher, festzustellen, dass Zuckermahlzeiten im Einvernehmen mit früheren Arbeiten konstant kleiner sind als Blutmahlzeiten34 (Abbildung 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Abbildung 1: Einrichtung der Glytube-Methode zur Fütterung von Mücken. (A) Schemat eines dekonstruierten Glytube, das verwendet wird, um Blut und andere Mahlzeiten an Mücken zu füttern. (B) Schemat eines Glytube präsentiert auf einem Behälter von Mücken mit einem Netzdeckel. Weibliche Mücken können durch den Netzdeckel durchdringen, um sich zu ernähren. (C) Fotos der Glytube (oben) und der weiblichen Aedes aegypti-Mücken vor, während und nach der Fütterung (unten, von links nach rechts) auf einer von Glytube gelieferten Mahlzeit. Moskitos wird gezeigt, wie sie durch das Netz, das ihren Behälter bedeckt, durchdringen, um auf den Membranförderer zuzugreifen. (D) Fotografien, die das Aussehen von weiblichen Ae. aegypti-Mücken zeigen, die nicht gefüttert werden (links) und die sich entweder auf einer künstlichen Blutmahlzeit (rechts, oben) oder einer kochigen + ATP-Mahlzeit (rechts, unten) eingeschlichen haben. Die Glytube-Methode wurde bereits in Costa-da-Silva et al. (2013)20veröffentlicht. Fotos in (C) und (D) sind mit freundlicher Genehmigung von Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Abbildung 2: Schematische Quantifizierung der Essensgröße nach Glytube-Blutfütterungsprotokoll. (A) Moskitos wird eine Mahlzeit mit Fluorescein (obere, experimentelle Gruppe) oder keine Mahlzeit (untere, ungeernährte negative Kontrollgruppe) angeboten. (B) Einzelne Mücken werden nach Beendigung des Fütterungsexperiments einer 96-Well-Platte zugesetzt. (C) Die Standardkurve wird unter Verwendung bekannter Mengen von Mehl mit 0,002 % Fluorescein erzeugt. (D) Mücken werden homogenisiert, um verbrauchtes Fluorescein freizusetzen, und die Fluoreszenzspiegel in jedem Brunnen werden mit einem Plattenleser quantifiziert. Diese Fluoreszenzquantifizierungsmethode wird von Liesch et al. (2013)34modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Abbildung 3: Glytube-Blutfütterungsexperiment mit fluoresceinbasierter Quantifizierung. (A) Standardkurvenmessungen aus den Brunnen, in denen eine Mücke aus der nicht gefütterten Kontrollgruppe einer bekannten Menge von Mehl zugesetzt wurde, die 0,002 % Fluorescein enthält (y-Achsenskala = beliebige Einheiten). (B) Das Mitnahmevolumen wurde unter Verwendung von Fluoreszenzwerten für Frauen in der nicht gefütterten Kontrollgruppe (links, schwarz, n = 40), der experimentellen Gruppe, die sich mit Blut ernährte (Mitte, Rot, n = 37), und der experimentellen Gruppe, die sich nicht von Blut ernährte (rechts, rot, n = 23), berechnet. Jeder Punkt stellt eine Messung von einem einzelnen Weibchen dar. Die Daten werden als Median mit Bereich angezeigt. Buchstaben zeigen statistisch unterschiedliche Gruppen an, Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleich, p<0.01. Diese Daten wurden in Jové et al. (2020)27veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Abbildung 4: Quantifizierung von Mahlzeiten mit unterschiedlicher Proteinzusammensetzung. Den Weibchen wurden Mahlzeiten entweder schafsblut (rot), künstliches Blut mit menschlichen Blutproteinen (Kogan (1990)22) (Orange) oder proteinfreie Saline + ATP-Mahlzeit (Aqua)7angeboten. (A) Der Anteil der mit Fluoreszenzmessungen bewerteten Frauen wurde bewertet. Jeder Punkt stellt eine Gruppe von 12 bis 16 Frauen dar. Die Daten werden als Mediane mit Bereichen n = 12 angezeigt. (B) Das mit Fluoreszenzmessungen berechnete Mahlvolumen. Jeder Punkt stellt eine Messung einer einzelnen Frau in einer einzigen Studie aus Abbildung 4A dar. Die Daten werden als Mediane mit Bereichen n = 12 angezeigt. (C) Anteil der Weibchen vollständig nach künstlicher Membranfütterung, bewertet durch Auge. Jeder Punkt stellt den Prozentsatz der Frauen dar, die aus Gruppen von 20 bis 30 Frauen stammen. Die Daten werden als Mediane mit Bereichen n = 23 angezeigt. (D) Die Als Gewicht/Weiblich bewerteten Mahlzeiten größen wurden nach dem Fütterungsstatus per Auge bewertet. Gewichte wurden als Durchschnitt der Gruppen von 5 Mücken berechnet. Die Daten werden als Mediane mit Bereichen n = 23 angezeigt. A–D: Buchstaben zeigen statistisch unterschiedliche Gruppen an, Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleich, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Abbildung 5: Quantifizierung von Mahlzeiten mit pharmakologischen Verbindungen. Weibchen konsumieren Mahlzeiten der gleichen Größe von Schafsblut (rot), Saline + ATP (aqua) und Saline + ATP + 100 M Dosis des menschlichen NPY Y2-Rezeptor-Agonisten TM30338 (dunkelblau). Das Mitnutzen des Mehlvolumens wird anhand von Fluoreszenzwerten berechnet. Jeder Punkt stellt eine Messung von einem einzelnen Weibchen dar. Die Daten werden als Mediane mit Bereichen n = 12 angezeigt. Buchstaben zeigen statistisch unterschiedliche Gruppen an, Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Mehrfachvergleich, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Abbildung 6: Quantifizierung kleinerer Nektarmahlzeiten. (A) Schematic des Nektar-Fütterungs-Assays. (B) Das mit Fluoreszenzmessungen berechnete Mahlvolumen für Wildweibchen bot Mahlzeiten entweder mit Wasser (blau, n = 36) oder 10 % Saccharose (grün, n = 53), jeweils mit 0,002 % Fluorescein, im Nektar-Fütterungstest an. Jeder Punkt stellt eine Messung von einem einzelnen Weibchen dar. Daten werden als Mediane mit Bereichen angezeigt. Buchstaben geben statistisch unterschiedliche Gruppen an, Mann-Whitney-Test, p<0.05. Diese Daten wurden in Jové et al. (2020)27veröffentlicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Künstliche Blutmahlzeit</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Konzentration der Lagerlösung (mg/ml)</td>
			<td>Volumen der Lagerlösung in Dermahlzeit (L/ml)</td>
			<td>Endmahlzeitkonzentration (mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Proteinkomponenten*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globulins</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hämoglobin</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumin</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtprotein</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Nicht-Protein-Komponenten</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Konzentration der Lagerlösung (mM)</td>
			<td>Volumen der Lagerlösung in Dermahlzeit (L/ml)</td>
			<td>Endmahlzeitkonzentration (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>In γ-Globulin-Bestand</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>In γ-Globulin-Bestand</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Proteinkomponenten werden in Stammlösung aus doppelt destilliertem Wasser hergestellt, mit Ausnahme von γ-Globulinen, die in 400 mM NaHCO3 gelöst werden und eine variable Menge an NaCl (2-4%) enthalten. im Produkt.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Rezept für die Zubereitung von künstlichen Blutmahlzeiten (angepasst an Kogan (1990)22). Künstliches Blut besteht aus Protein- und Nicht-Protein-Komponenten, die regelmäßig im menschlichen Blut gefunden werden, und bietet die Möglichkeit, die Verhältnisse dieser Komponenten zu variieren. Mücken können Eier produzieren, nachdem sie sich von künstlichem Blut ernährt haben7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Saline-Mahlzeit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Konzentration der Lagerlösung (mM)</td>
			<td>Volumen der Lagerlösung in Dermahlzeit (L/ml)</td>
			<td>Endmahlzeitkonzentration (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wasser</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Rezept für Kochzimmer mit ATP (angepasst von Duvall et al. (2019)7). Proteinfreie Kochchenkönnen können verwendet werden, um Verbindungen von Interesse an Mücken zu liefern, während sie immer noch die Abdominaldistension imitieren, die nach der Blutfütterung auftritt, aber ohne die Eientwicklung auszulösen, die auftritt, wenn Proteine aufgenommen werden.

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Das Ziel dieses Protokolls ist es, tierische und künstliche Blutmahlzeiten an Aedes aegypti Mücken durch einen künstlichen Membran-Feeder zu liefern und das Volumen der aufgenommenen Mahlzeit genau zu quantifizieren.

Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.6K Aufrufe.  The Rockefeller University. Das Ziel dieses Protokolls ist es, tierische und künstliche Blutmahlzeiten an Aedes aegypti Mücken durch einen künstlichen Membran-Feeder zu liefern und das Volumen der aufgenommenen Mahlzeit genau zu quantifizieren.

Serie: Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; AGB in einen engeren Bezug zu den Mukoviszidose-Lunge

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).