El yazmaları hakkındaki yorumları için Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai ve Trevor Sorrells'e ve teknik yardım için Zhongyan Gong ve Kyrollos Barsoum'a teşekkür ederiz. Şekil 1'dekullanılan fotoğraflar için Alex Wild'a teşekkür ederiz. K.V., Boehringer Ingelheim Fonds doktora bursu tarafından desteklendi. V.J. kısmen NIH T32-MH095246 tarafından desteklendi. Bu çalışma kısmen Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden The Rockefeller Üniversitesi'ne James H. Gilliam İleri Çalışma Bursları programı aracılığıyla V.J.'ye verilen bir hibe ile desteklendi. Bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No. NSF DGE-1325261'den V.J.'ye Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazar(lar)ın görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

<ol>
	<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li><li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue.">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li><li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus.">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+virus+infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias.">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history,+emergence,+biology,+and+prospects+for+control.">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes:+implications+for+anautogeny.">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li><li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting.">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li><li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti.">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li><li>Guerrero, D., Cantaert, T., Miss&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses.">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li><li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands.">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li><li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+(diptera:+Culicidae).">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li><li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission.">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li><li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li><li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia.">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li><li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti.">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li><li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans.">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li><li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus.">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li><li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka.">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).</li><li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glytube:+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).</li><li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil.">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li><li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+mosquitoes.">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+stimuli+and+artificial+feeding.">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+response+in+Aedes+aegypti:+stimulation+by+adenosine+triphosphate.">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li><li>Jov&#233;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li><li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity.">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li><li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako,+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+(ATSB).">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).</li><li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+(L.)+(Diperta:+Culicidae).">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li><li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope.">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+SkitoSnack,+an+artificial+blood+meal+replacement,+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota.">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior.">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).</li><li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet.">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li><li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact.">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li><li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector,+Aedes+aegypti,+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand.">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).</li><li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiteOscope,+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior.">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Birçok laboratuvar uygulaması için yapay membran besleyiciler, araştırmacılara yemeğin içeriğini doğrudan manipüle etme olanağı sağlayarak canlı konakçılara kıyasla farklı faydalar sunar. Yapay membran besleme için birden fazla yöntem mevcut olsa da, burada açıklanan yöntem esneklik, maliyet ve verimde avantajlar sunar. Diğer ticari membran besleyicilere kıyasla, Glytube tahlili küçük bir yemek hacmi gerektirir, bu da onu 7,35gereken toplam hacmi en aza indirerek ilaçlar veya patojenler de dahil olmak üzere pahalı reaktifler için verimli bir teslimat mekanizmasıhalinegetirir. Hem protein içermeyen tuzlu su hem de yapay kan yemekleri engorgement'i teşvik ettiği için, bileşikler veya patojenler her iki öğüne de enjeksiyonlara yüksek verimli ve invaziv olmayan bir alternatif olarak eklenebilir. Ayrıca, Glytube'un her bileşeni, besleme cihazının çapraz kirlenmesi olmadan birden fazla yemek türünü teslim etmek ve ölçmek için kolayca yıkanabilir, değiştirilebilir veya ölçeklendirilebilir.
Sivrisinekler tarafından tüketilen yemek hacimlerini ölçmek için, floresan bazlı yöntem, sivrisinekleri beslenmeden önce ve sonra tartmaya göre daha hassas yemek boyutu nicelemesi sağlar. Bu yöntemin bir bitiş noktası tahlil olduğu unutulmamalıdır. Buna karşılık, tartım sivrisineklerin daha fazla deney için canlı tutulmasını sağlar. Bir plaka okuyucu kullanarak, floresan tabanlı yöntem, yüzlerce bireysel kadın tarafından tüketilen öğünlerin yüksek verimli nicelemesi için kolayca ölçeklendirilebilir.
Yüksek beslenme oranları elde etmek için, kadın konakçı arama davranışını etkinleştirmek ve dişileri besleyiciye çekmek için yeterli konak ipuçlarının bir kombinasyonu bulunmalıdır. Sivrisinekler Glytube'un altında kalabalık değilse, yemek düzgün ısıtılamayabilir veya CO2 teslimatı yeterli olmayabilir. Membran yüzeyine insan kokusu eklenmesi, yapay zarın çekiciliğini güvenilir bir şekilde arttırır. Sivrisinekler Glytube'un altında görülürse, ancak beslenemezse, yemek bileşimi hatalı olabilir. Dişiler, yemeğin kendisi sıcak değilse, kan çok eskiyse veya yemeğe katkı maddeleri özünde averatifse veya istenmeyen bir kimyasal reaksiyona neden olursa beslenmeyebilir36. Ek ATP ayrıca beslenme oranlarını güvenilir bir şekilde artırır ve sağlanan tariflerin her birinde 2 mM'lik son konsantrasyona kadar ölçeklendirilebilir. Parafilm Glytube kapağı boyunca gergin çekilmezse dişiler beslenmeyebilir; parafilm düzgün bir şekilde şeffaf olmalı ve tokalanmamalıdır, çünkü bu, dişinin parafilm'i tarzıyla etkili bir şekilde delebilmesini önler. Yemek Glytube'dan örgüye sızarsa, parafilm germe işlemi sırasında yırtılmış olabilir ve değiştirilmelidir.
Yemek bileşimini değiştirmek, araştırmacıların yemeği midgut'tan temizlemek için gereken süreyi ve sonraki konakçı arama davranışını manipüle etmelerine de izin verebilir. Burada sunulan yemekler, hayvansal türevi kana benzer 7 sindirim için24-36 saat gerektirir. Bu yemeklerden herhangi birini besledikten sonra, dişiler sindirim süresi boyunca konakçı arayışını bastıracaktır. Tuzlu yemek proteinden yoksun olduğundan, dişiler yemek temizlendikten sonra ev sahibi arayışına geri dönerler. Daha hızlı bir geri dönüş isteniyorsa, araştırmacılar yaklaşık 6 saat27içinde atılan alternatif "hızlı temizleme" tuzlu su öğünlerini seçebilirler. Burada sunulan tuzlu yemeğin bileşimi, sonuçları yapay kan unu ile doğrudan karşılaştırmak için eşleştirilirken, "hızlı temizleme" unu omurgalı kanda bulunan fizyolojik tuz seviyeleriyle daha yakından eşleşir.
Burada açıklanan yöntemler, araştırmacının deneysel hedeflerine en uygun tahlilleri seçmeden önce dikkate alınması gereken sınırlamalara sahiptir. Açıklanan floresan ölçümleri, sivrisineklerin ek deneyler için tekrar kullanılmasına izin vermez. Bununla birlikte, floresan tahlil kullanılarak öğün büyüklüğü ölçümü öncesinde ağırlık ölçümleri yapılabilir. Kilo ve yemek boyutu belirli bir yemek için birden fazla denemede tutarlıysa, ağırlık gelecekteki deneylerde proxy olarak kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol konak aramadaki açıklarla kan besleme davranışı arasındaki ayrımı yapmaz; membran besleyicinin bulunmasında bozukluklar gösteren sivrisineklerin beslenme oranlarında ve/veya yemek boyutunda bir azalma olacaktır. Araştırmacılar, test boyunca davranışı kaydetmek için bir kamera ekleyerek, dişilerin Glytube'u bulup bulamadıklarını veya Glytube'u bulup bulamadıklarını, ancak beslenmediklerini belirleyebilirler.
Burada açıklanan test, sivrisineklerde beslenme davranışı ile ilgili birçok olağanüstü soruyu araştırmak için uyarlanabilir. Örneğin, belirli kan proteinlerinin katkısı, bileşen proteinlerin oranını veya yapay kan unundaki toplam protein konsantrasyonu değiştirilerek araştırılabilir. Birden fazla besleme etkinliğinden yemek boyutlarını değerlendirmek için, öğünleri benzersiz kaynaklardan ayırt etmek için farklı floresan spektrumlu boyalar eklenebilir37. Bu protokol ayrıca kanı algılayan ve yutulması için kullanılan iç ağız partilerini (yani stile) ve sivrisinek kan beslemeye başlamak için inerken cilde (yani labium, bacaklara) temas eden kemosentory ekleri ayrı ayrı uyarmak için de değiştirilebilir36. Örneğin, ligandlar doğrudan yemeğe eklenirse, membran sadece stylet tarafından delindiği için labium ve bacaklarla temas etmezler. Bunun yerine parafilm'in dış yüzeyine ligandlar eklenirse, yemekten ayrı kalırlar ve labium ve bacaklar ile temas edebilir36. Son olarak, kan besleme davranışının ayrıntılı kinetiği iyi anlaşılmamıştır ve burada sunulan yöntem, yüksek çözünürlüklü izlemeyi makine öğrenimi araçlarıyla birleştirerek hareket, duruş ve besleme dinamiklerinin davranışsal okumalarını çıkarmak içindeğiştirilebilir 38.
Bu protokol, sivrisinek kanı besleme ve kan sonrası besleme davranışlarını incelemek için farmakolojik ve genetik manipülasyonlar kullanan araştırmacılara hizmet etme yeteneği ile kullanıcı dostu ve uygun maliyetli olmayı amaçlamaktadır.

Değiştirilmiş kan yemeklerini yapay bir membran besleyici kullanarak Aedes aegypti sivrisineklerine beslemek ve her bir sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacmini hassas bir şekilde ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yemeğin içeriğini değiştirmek veya farklı deneysel sivrisinek grupları tarafından tüketilen yemek hacmini karşılaştırmak için esnek bir şekilde uyarlanabilir.
Ae. aegypti sivrisinek, sarıhumma, dang humması, chikungunya ve Zika 1, 2 ,3,4,5gibi hastalıklara nedenolanpatojenleri yayarak küresel sağlığı tehdit eder. Ae. aegypti dişileri zorunlu kan besleyicilerdir; yumurta gelişimi için gerekli proteini elde etmek için omurgalı kan tüketmelidirler ve her bir yumurta debriyajı en az bir konak6, 7,8'dentam bir kan unu gerektirir. Dişi sivrisinek ilk olarak cildi stylet ile delerek ve konağın bağışıklık tepkisini tetikleyen bileşikler içeren tükürük enjekte ederek konağını ısırır9. Daha sonra midgut'una stile kan pompalayarak beslenir. Enfekte bir konaktan bir kan unu tüketirken, kan kaynaklı patojenleriyutabilir 6,8, daha sonra sivrisinek midgutundan tükürük bezlerine göç edebilir10. Bu şekilde enfekte olan dişi sivrisinekler, sonraki konakları ısırırken tükürükle birlikte patojen enjekte ederek hastalık yayabilir11,12. Kan besleme davranışının mekanizmalarını anlamak ve ölçmek, sivrisinek kaynaklı hastalıkların bulaşmasını kontrol etmede çok önemli adımlardır.
Sivrisinek yetiştirme ve deneyler için birçok laboratuvar protokolü, fareler, kobaylar veya insanlar dahil olmak üzere canlı hayvanları kan kaynağı olarak kullanır13,14,15,16. Canlı hayvanların kullanımı, etik kaygıların yanı sıra personel eğitimi, hayvan barınması ve bakımı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) politikalarına uyum için karmaşık gereksinimler getirmektedir. Ayrıca sivrisineklere teslim edilebilecek bileşik türlerini sınırlar, bu da gerçekleştirilebilecek çalışmaları kısıtlar17.
Tipik olarak konakçı cildi simüle etmek için bir membran sistemi kullanan yapay kan besleme aparatları, canlı konakçıların bakımı ihtiyacını atlatan kan besleme davranışlarını incelemek için yararlı araçlardır. Tam kan bir dizi satıcıdan satın alınabilir ve ısıtılmış, su ceketli yapay membran besleyiciler veya benzeri cihazlar kullanılarak sivrisineklere beslenebilir18,19. Bu protokolde, "Glytubes" olarak adlandırdığımız küçük, tek kullanımlık membran besleyicilerin kullanımını gösteriyoruz. Daha önce Costa-da-Silva ve ark. (2013)20tarafından yayınlanan bu membran besleyici, standart laboratuvar ekipmanlarından kolayca monte edilebilir, bu da kan yemeklerini ılımlı sayıda sivrisineklere ulaştırmak için idealdir ve daha büyük grupları veya birden fazla yemek formülasyonunu test etmek için ölçeklendirmek için basittir. Glytube, daha büyük yemek hacimleri gerektirebilecek ve tek bir öğün formülasyonunda büyük sivrisinek gruplarını toplu olarak beslemek için daha uygun olan diğer ticari yapay besleyicilere ucuz ve verimli bir alternatiftir21.
Bu protokol iki bölüm içerir: yapay yemeklerin hazırlanması/sunulması ve tüketimin ölçülmesi. İlk bölümde, Glytube'lar manipüle edilmiş diyetler sunmak için etkili bir araç olarak kullanılır. Bütün kan, bir kan unu yerine kan ikamelerinin etkilerini karşılaştırmak için tamamen yapay bir yemekle ikame edilebilir. Kogan (1990)22'den uyarlanan bir tarif burada sunulmaktadır, ancak birden fazla yapay yemek formülasyonu geliştirilmiştir23,24. Ayrıca, beslenme, farmakolojik bileşikleri enjeksiyondan daha az invaziv ve daha az zahmetli bir yöntemdir. Her öğün için gereken düşük toplam hacim (1-2 mL) nedeniyle, bu protokol pahalı reaktiflerin miktarlarını azaltmak için cazip bir teslimat yöntemi sağlar. Ae. aegypti dişiler kolayca adenozin ile tuzlu çözelti proteinsiz yemekler tüketin 5′-trifosfat (ATP)25,26, hangi tek öğün bileşenlerinin etkilerini ölçmek için bir taban çizgisi sağlar. Örneğin, Ae. aegypti'deki Neuropeptide Y benzeri reseptör 7 'nin (NPYLR7), protein bakımından zengin bir kan yemeğinden sonra konak arayan baskılamaya aracılık ettiği bilinmektedir ve NPYLR7 agonistleri proteinsiz bir tuzlu yemeğe eklendiğinde, dişi sivrisinekler tam kan tüketenlere benzer konak arayan baskılama sergilerler7.
İkinci bölümde, bireysel bir dişi sivrisinek tarafından tüketilen her yemeğin hacmini ölçmek için adımlar sunulmaktadır. Bu test floresan bazlıdır ve sadece karın distansiyonunun görsel değerlendirmesine dayanarak kadınların "beslenen" veya "beslenmemiş" olarak sınıflandırıldığı yöntemlerden daha yüksek çözünürlükte beslenme durumunu yakalar. Beslenmeden önce yemeğe floresan eklenerek, bireyler tarafından yutulan yemek hacimleri, her sivrisinek 96 kuyulu bir tabakta homojenleştirilerek ve floresan yoğunluğu okuma olarak ölçülerek ölçülebilir. Bu tahlil, yemek bileşimi veya sivrisineklerin genetik arka planı gibi değişkenlere yanıt olarak beslenme dinçliğindeki farklılıkları ölçebilir. Kesin niceleme ara öğün boyutları için kritik öneme sahiptir, örneğin kadınlara beslenme caydırıcıları içeren yetersiz yemekler sunulduğunda veya değişken boyutlarda sakkaroz yemekleri tükettiğinde27. Beslenen sivrisinekler, yemek büyüklüğü ölçülmesi sonrasında sonraki davranışsal tahliller için gerekliyse, bunun yerine anestezi edilmiş dişilerin gruplar halinde tartılması ve birey başına ortalama artan kütlenin tahmin edilmesiyle yemek büyüklüğü hesaplanabilir. Floresan işaretinden daha az kesin olmasına rağmen, tartım hala öğün hacminin toplu bir tahminini sağlar ve yemeğin doğurganlık veya sonraki konak cazibesi gibi aşağı akış süreçleri üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. Kan unu boyutu değişkendir ve burada açıklanan yöntemlerle ölçülen11,28,29,yutmuş yemek boyutlarının sayısız faktöründen etkilenebilirken, önceki nicelemeler 7 ,30,31ile tutarlıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Bazı sivrisinek türlerinin dişileri, yumurta gelişimi için gerekli protein bakımından zengin kan yemekleri elde etmek için omurgalı konakları ısırırken hastalıkları yayabilir. Laboratuvarda araştırmacılar, yemek kompozisyonunun manipülasyonuna izin veren membran besleyiciler aracılığıyla sivrisineklere hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri teslim edebilir. Burada, Aedes aegypti sivrisineklerine kan ve yapay kan yemeklerini beslemek ve bireysel dişiler tarafından tüketilen hacmi ölçmek için yöntemler sunuyoruz.
Yapay / kan yemeklerinin hedefli beslenmesi ve nicelleştirilmesi, yemek bileşenlerinin sivrisinek davranışı ve fizyolojisi üzerindeki etkilerini test etmek, enjeksiyon olmadan farmakolojik bileşikler sunmak ve sivrisinekleri belirli patojenlerle enfekte etmek de dahil olmak üzere geniş kullanım alanlarına sahiptir. Beslenmeden önce yemeğe floresan boyası eklemek, sonraki öğün boyutunun ölçülmesini sağlar. Sivrisinekler tarafından tüketilen yemek hacmi, dişiler daha sonra davranış deneyleri için kullanılacaksa, ağırlıkla veya 96 kuyulu tabaklarda tek tek kadınları homojenleştirerek ve bir plaka okuyucusu test olarak bir plaka okuyucu kullanarak floresan seviyelerini ölçerek ölçülebilir. Yemek boyutu nicelemesi, yemek bileşenlerinin değiştirilmesinin yutlanan yemek hacmini değiştirip değiştirmediğini veya yemek tüketiminin sivrisinek suşları arasında farklılık gösterip değiştirmediğini belirlemek için kullanılabilir. Hassas yemek boyutu nicelemesi, konak cazibesi veya doğurganlık üzerindeki etkileri ölçenler gibi aşağı akış tahlilleri için de kritik öneme sahiptir. Burada sunulan yöntemler, günler boyunca yemek sindirimini izlemek veya her yemeğin tek bir sivrisinek tarafından tüketimini ölçmek için farklı öğünlere (nektar ve kan gibi) eklenen birden fazla ayırt edilebilir belirteç içerecek şekilde daha da uyarlanabilir.
Bu yöntemler, araştırmacıların yüzlerce bireysel sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacmini karşılaştırmak için tek başına yüksek verimli ölçümler yapmalarına izin verir. Bu nedenle bu araçlar, çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için sivrisinek araştırmacıları topluluğu için geniş ölçüde yararlı olacaktır.

Şekil 1, Glytube'u monte etmek için bir şema sunarken, Şekil 2 burada açıklanan floresan bazlı tahlilleri kullanarak yemek boyutunu ölçmek için deneysel tasarıma genel bir bakış göstermektedir. Şekil 3, kan besleme deneyinden temsili floresan yemek boyutu ölçümleri sağlar. Şekil 4, Şekil 5ve Şekil 6, bu protokol kullanılarak ele alınabilecek biyolojik soruların bir örneğini göstermektedir. Protokolün uygulamaları geniş kapsamlıdır ve kan unu bileşimini değiştirmeyi, farmakolojik bileşikleri beslemeyi, en uygun alt kan yemeklerini veya daha küçük nektar öğünlerini hassas bir şekilde ölçmeyi ve sivrisinek genotipleri arasında beslenme davranışını karşılaştırmayı içerir.
Yemek hacmi hesaplamaları için standart bir eğri oluşturmak için, floresan okumaları, her biri beslenmemiş bir sivrisinek ve % 0.002 floresan içeren bilinen bir yemek hacmi içeren belirlenen referans kuyularından çizilir (Şekil 3A). Gıdasız sivrisineklerin negatif kontrol grubundan veya bir yemek sunan deneysel sivrisinek grubundan sivrisinekler içeren kalan kuyulardan gelen floresan okumaları, her sivrisinek tarafından tüketilen yemek hacmini (μL) ölçmek için bu standart eğri ile karşılaştırılır (Şekil 3B). Bu testteki temel okumaları doğrulamak için, kullanılmamış negatif kontrol grubundan sivrisineklere tüketilen μL pozitif bir değer atanmadığını teyit edilmelidir (Şekil 3B, sol). Deneysel gruptaki tüm kadınlara kan unu teklif edilse de, bazı sivrisinekler beslendi (Şekil 3B, orta) ve bazıları yapmadı (Şekil 3B, sağ). Bu sonuç, bu protokolden iki tür veri elde edilebileceğini göstermektedir: 1) belirli bir yemekle beslenen toplam dişilerin yüzdesi ve 2) belirli bir yemekle beslenen dişiler tarafından alınan hacim.
Bu protokol, çeşitli protein bileşimleri ile öğünleri sunmak ve ölçmek için kullanılabilir. Şekil 4A,B, ilave floresan içeren yemekler kullanılarak toplanan verileri gösterir. Beslenen sivrisineklerin oranı ve yutmuş oldukları yemek hacmi sırasıyla floresan okumalarından hesaplanmıştır. Bu okumalar son derece hassastır ve μL'nin hassas bir şekilde ölçülmesine izin verir, ancak sivrisineklerin gelecekteki canlı deneyler için kullanılamayacağı sınırlamasına sahiptir. Şekil 4C,D, floresansız yemekler sunulduktan sonra gözle beslenmiş veya beslenmemiş olarak puanlanan sivrisineklerle yapılan bağımsız bir deneyden toplanan verileri göstermektedir. Yemek büyüklüğü 5 sivrisinek grubundan ortalama ağırlık / dişi olarak hesaplandı. Bu ağırlık ölçümleri floresan ölçümlerinden daha az hassas olmasına rağmen, kadınların daha fazla canlı deney için kurtarılmasına ve kullanılmasına izin verir. Beslenen sivrisineklerin oranı, Şekil 4A ve Şekil 4C'ye yansıdığı gibi farklı deneysel günlerde değişebilir.
Şekil 5, sivrisinek konakçısı arama davranışını düzenleyen ilaçlar içeren öğünlerin tüketilen hacmini göstermektedir. Bu deneylerde, dişilere insan NPY Y2 reseptör agonisti TM30338'in 100 μM'si ile kan, salin + ATP veya salin + ATP yemekleri önerildi. Bu ilaç, Ae. aegypti NPY benzeri reseptörü 7'nin aktivasyonu yoluyla konak arama davranışını değiştirir. Yemek boyutlarının ölçülmesi, bu ilacın kan besleme sonrası davranış üzerindeki etkisini değerlendirmek için deneylerin yorumlanması için kritik öneme sahiptir, çünkü araştırmacının her kadın tarafından tüketilen dozu hesaplamasına izin verir.
Önceki örneklerde, dişiler kan veya yedek kan yemekleriyle beslendi ve bunların hepsi 3-5 μL öğünle sonuçlandı(Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5). Bu floresan bazlı test, ortalama grup ağırlığı ölçümlerinden doğru bir şekilde ayırt edilemeyen daha küçük ve/veya daha değişken yemek boyutlarını ölçmek için de kullanılabilir. Şekil 6'da,Glytube'u% 0.002 floresan içeren% 10 sakkaroz ile doymuş bir pamuk topu ile değiştirerek nektar besleme davranışını ölçmek için aynı floresan nicelleştirme protokolü kullanılmıştır. Nektar şekerleri Glytube testinde sunulamaz, çünkü dişiler nektar şekerlerinin varlığını stylet ile tespit edemez ve beslemeye başlamaz27. Bu veriler, araştırmacının şeker yemeklerinin önceki çalışma34 (Şekil 6)ile uyumlu olarak kan yemeklerinden sürekli olarak daha küçük olduğunu belirlemesine izin verir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Şekil 1: Sivrisineklere yemek yedirmek için kullanılan Glytube yönteminin kurulumu. (A) Sivrisineklere kan ve diğer öğünleri beslemek için kullanılan yapısız bir Glytube şeması. (B) Bir Glytube şeması, ağ kapaklı bir sivrisinek kabının üzerine sunuldu. Dişi sivrisinekler beslenmek için ağ kapağını delebilir. (C) Glytube tarafından verilen bir yemekte beslenmeden önce, sırasında ve sonra (alttan sağa) Glytube (üstte) ve dişi Aedes aegypti sivrisineklerinin fotoğrafları. Sivrisinekler, membran besleyiciye erişmek için kabını kaplayan ağdan delici olarak gösterilir. (D) Dişi Ae. aegypti sivrisineklerinin görünümünü gösteren fotoğraflar, suni kan unu (sağ, üst) veya salin + ATP yemeği (sağ, alt). Glytube yöntemi daha önce Costa-da-Silva ve ark. (C) ve (D) fotoğraflarında Alex Wild'ın izniyle çekilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Şekil 2: Glytube kan besleme protokolünden sonra yemek boyutunun nasıl ölçülecek şeması. (A) Sivrisineklere floresan (üst, deneysel grup) veya yemeksiz (alt, bozulmamış negatif kontrol grubu) bir yemek sunulmaktadır. (B) Besleme deneyi sonlandırıldıktan sonra 96 kuyulu bir tabağa tek tek sivrisinekler eklenir. (C) Standart eğri% 0.002 floresan içeren bilinen miktarda yemek kullanılarak oluşturulur. (D) Sivrisinekler tüketilen herhangi bir floresanı serbest bırakmak için homojenize edilir ve her kuyudaki floresan seviyeleri bir plaka okuyucu kullanılarak ölçülür. Bu floresan nicelleştirme yöntemi Liesch ve ark. (2013)34'ten değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Şekil 3: Floresan bazlı niceleme ile glytube kan besleme deneyi. (A) %0,002 floresan (y ekseni ölçeği = keyfi birimler) içeren bilinen bir öğün miktarına, el değmemiş kontrol grubundan bir sivrisineğin eklendiği kuyulardan elde edilen standart eğri ölçümleri. (B) Beslenmemiş kontrol grubundaki (sol, siyah, n = 40), kanla beslenen deney grubu (orta, kırmızı, n = 37) ve kanla beslenmeyen deney grubu (sağ, kırmızı, n = 23) için floresan okumaları kullanılarak hesaplanan yemek hacmi. Her nokta, tek bir dişiden gelen bir ölçümü temsil eder. Veriler aralıklı ortanca olarak gösterilir. Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Kruskal-Wallis Dunn'ın çoklu karşılaştırması ile test eder, p<0.01. Bu veriler Jové ve ark. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Şekil 4: Farklı protein bileşimine sahip öğünlerin nicelemesi. Dişilere koyun kanı (kırmızı), insan kanı proteinli yapay kan (Kogan (1990)22) (turuncu) veya proteinsiz salin + ATP yemeği (aqua)7yemekleri sunuldu. (A) Beslenen kadınların yüzdesi floresan okumaları kullanılarak puan aldı. Her puan 12-16 kadından oluşan bir grubu temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 12. (B) Floresan okumaları kullanılarak hesaplanan yemek hacmi. Her nokta, Şekil 4A'dantek bir denemede tek bir dişiden bir ölçümü temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 12. (C) Yapay membran beslemeden sonra tamamen saran kadınların yüzdesi, gözle puanlandı. Her nokta, 20-30 kadından oluşan gruplardan elde edilen kadınların yüzdesini temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 23. (D) Beslenme durumu göz göre göre puanlandıktan sonra kilo/kadın olarak puanlanan yemek ölçüleri. Ağırlıklar 5 sivrisinek grubunun ortalaması olarak hesaplandı. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 23. A–D: Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Kruskal-Wallis Dunn'ın çoklu karşılaştırması ile test eder, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Şekil 5: Farmakolojik bileşiklerle öğünlerin nicelemesi. Dişiler aynı büyüklükteki koyun kanı (kırmızı), salin + ATP (aqua) ve salin + ATP + 100 μM doz insan NPY Y2 reseptör agonist TM30338 (koyu mavi) tüketir. Floresan okumalar kullanılarak hesaplanan yemek hacmi. Her nokta, tek bir dişiden gelen bir ölçümü temsil eder. Veriler, aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir, n = 12. Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Kruskal-Wallis Dunn'ın çoklu karşılaştırmasıyla test eder, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Şekil 6: Daha küçük nektar yemeklerinin nicelemesi. (A) Nektar besleme tahlil şeması. (B) Vahşi tip kadınlar için floresan okumaları kullanılarak hesaplanan yemek hacmi, nektar besleme testinde her biri% 0.002 floresan içeren su (mavi, n = 36) veya% 10 sakkaroz (yeşil, n = 53) yemekleri sundu. Her nokta, tek bir dişiden gelen bir ölçümü temsil eder. Veriler aralıkları olan ortancalar olarak gösterilir. Harfler istatistiksel olarak farklı grupları gösterir, Mann-Whitney testi, p<0.05. Bu veriler Jové ve ark. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Yapay Kan Unu</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Stok Çözeltisinin Konsantrasyonu (mg/mL)</td>
			<td>Yemekte Stok Çözeltisinin Hacmi (μL/mL)</td>
			<td>Son Öğün Konsantrasyonu (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Protein Bileşenleri*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globulinler</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemoglobin</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albümin</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam Protein</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Protein Olmayan Bileşenler</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Stok Çözeltisinin Konsantrasyonu (mM)</td>
			<td>Yemekte Stok Çözeltisinin Hacmi (μL/mL)</td>
			<td>Son Öğün Konsantrasyonu (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>γ-globulin stokunda</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>γ-globulin stokunda</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Protein bileşenleri, 400 mM NaHCO3'te çözünen ve değişken miktarda NaCl (%2-4) içeren γ-Globulinler hariç, çift damıtılmış suyun stok çözeltisinde hazırlanır. üründe.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Yapay kan yemekleri hazırlama tarifi (Kogan'dan uyarlanmıştır (1990)22). Yapay kan, insan kanında düzenli olarak bulunan protein ve protein dışı bileşenlerden oluşur ve bu bileşenlerin oranlarını değiştirme seçeneği sunar. Sivrisinekler yapay kanla besledikten sonra yumurta üretebilir7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tuzlu Su Yemeği</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Stok Çözeltisinin Konsantrasyonu (mM)</td>
			<td>Yemekte Stok Çözeltisinin Hacmi (μL/mL)</td>
			<td>Son Öğün Konsantrasyonu (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: ATP ile tuzlu yemek tarifi (Duvall ve ark. (2019) 7'den uyarlanmıştır). Protein içermeyen tuzlu su yemekleri, kan beslemeden sonra meydana gelen karın distansiyonunu taklit ederken, ancak proteinler yutulduğunuzda ortaya çıkan yumurta gelişimini tetiklemeden sivrisineklere ilgi bileşikleri sunmak için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Bu protokolün amacı, yapay bir membran besleyici aracılığıyla Aedes aegypti sivrisineklerine hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri sunmak ve yutturılan yemek hacmini tam olarak ölçmektir.

Aedes aegypti Sivrisineklerinde Hayvansal Türevli Kan ve Yapay Yemeklerin Beslenmesi ve Ölçülmesi

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.6K Görüntüleme.  The Rockefeller University. Bu protokolün amacı, yapay bir membran besleyici aracılığıyla Aedes aegypti sivrisineklerine hayvansal türevli ve yapay kan yemekleri sunmak ve yutturılan yemek hacmini tam olarak ölçmektir.

Video: Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Kompleman tükenmesi Özel Hücre Populasyonlarının tükenmesi

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Lyme Hastalığı Araştırma İletim ve Xenodiagnosis için Hayvanlar Keneler besleme

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...