Agradecemos a Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai e Trevor Sorrells pelos comentários sobre os manuscritos, e Zhongyan Gong e Kyrollos Barsoum pela assistência técnica. Agradecemos a Alex Wild pelas fotografias usadas na Figura 1. K.V. foi apoiado pela bolsa de doutorado Da Boehringer Ingelheim Fonds. V.J. foi apoiado em parte pelo NIH T32-MH095246. Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa para a Universidade Rockefeller do Instituto Médico Howard Hughes através do programa James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study para V.J. Este material é baseado em trabalho apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência sob o Grant No. NSF DGE-1325261 para V.J. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são do autor e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

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Os autores não têm nada a revelar.

Para muitas aplicações de laboratório, os alimentadores de membrana artificial oferecem benefícios distintos em comparação com os hosts vivos, permitindo aos pesquisadores a capacidade de manipular diretamente o conteúdo da refeição. Embora vários métodos estejam disponíveis para alimentação artificial de membrana, o método descrito aqui oferece vantagens em flexibilidade, custo e throughput. Em comparação com outros alimentadores de membrana comercial, o ensaio do Glytube requer um pequeno volume de refeição, tornando-se um mecanismo de entrega eficiente para reagentes caros, incluindo medicamentos ou patógenos, minimizando o volume total necessário7,35. Como tanto o soro fisiológico sem proteínas quanto as refeições artificiais de sangue promovem o engorgador, compostos ou patógenos podem ser adicionados a qualquer refeição como uma alternativa de alta produtividade e não invasiva às injeções. Além disso, cada componente do Glytube pode ser facilmente lavado, substituído ou dimensionado para entregar e quantificar vários tipos de refeições sem contaminação cruzada do aparelho alimentar.
Para quantificar os volumes de refeição consumidos pelos mosquitos, o método baseado em fluorescência permite uma quantificação mais precisa do tamanho da refeição do que pesar os mosquitos antes e depois da alimentação. Deve-se notar que este método é um ensaio de ponto final. Em contraste, a pesagem permite que os mosquitos sejam mantidos vivos para mais experimentos. Usando um leitor de pratos, o método baseado em fluorescência pode ser facilmente dimensionado para quantificação de alta produtividade de refeições consumidas por centenas de fêmeas individuais.
Para alcançar altas taxas de alimentação, uma combinação de pistas suficientes de hospedeiro deve estar presente para ativar o comportamento feminino em busca de hospedeiros e atrair fêmeas para o alimentador. Se os mosquitos não estiverem se aglomerando sob o Glytube, a refeição pode não ser adequadamente aquecida, ou a entrega de CO2 pode não ser suficiente. A adição de odor humano à superfície da membrana aumenta de forma confiável a atratividade da membrana artificial. Se os mosquitos forem observados sob o Glytube, mas não se alimentarem, a composição da refeição pode ser a culpada. As fêmeas não podem se alimentar se a refeição em si não estiver quente, o sangue é muito velho, ou se os aditivos para a refeição são intrinsecamente aversivos ou causam uma reação química indesejável36. ATP adicional também aumenta de forma confiável as taxas de alimentação e pode ser dimensionada até uma concentração final de 2 mM em cada uma das receitas fornecidas. As fêmeas não podem se alimentar se o parafilm não for puxado esticada através da tampa do Glytube; o parafilme deve ser uniformemente transparente e não deve dobrar, pois isso impede que a fêmea seja capaz de efetivamente perfurar o parafilme com seu estomado. Se a refeição vazar através do Glytube na malha, o parafilme pode ter rasgado durante o processo de alongamento e deve ser substituído.
A alteração da composição da refeição também pode permitir que os pesquisadores manipulem o tempo necessário para limpar a refeição do midgut, bem como o comportamento subsequente de busca de hospedeiros. As refeições aqui apresentadas requerem 24-36 h para digestão7 semelhante ao sangue derivado de animais. Depois de se alimentar em qualquer uma dessas refeições, as fêmeas suprimirão a busca de hospedeiros durante a janela de tempo de digestão. Como a refeição salina carece de proteína, as fêmeas voltam à busca de acolhimento após a refeição ser liberada. Se um retorno mais rápido for desejável, os pesquisadores podem escolher refeições salinas alternativas de "limpeza rápida" que são excretadas em aproximadamente 6 h27. Embora a composição da refeição salina aqui apresentada aqui seja combinada com a comparação direta dos resultados com a refeição artificial do sangue, a refeição de "limpeza rápida" corresponde mais de perto aos níveis fisiológicos de sal encontrados no sangue dos vertebrados.
Os métodos aqui descritos têm limitações que devem ser consideradas antes de selecionar o ensaio mais adequado aos objetivos experimentais do pesquisador. As medidas de fluoresceína descritas não permitem que os mosquitos sejam usados novamente para experimentação adicional. No entanto, as medidas de peso podem ser tomadas antes da quantificação do tamanho da refeição usando o ensaio de fluoresceína. Se o peso e o tamanho da refeição forem consistentes em vários ensaios para uma determinada refeição, o peso pode ser usado como proxy em experimentos futuros. Além disso, este protocolo não distingue entre déficits na busca de hospedeiros versus comportamento de alimentação sanguínea; mosquitos que apresentem prejuízos ao encontrar o alimentador de membrana terão uma redução nas taxas de alimentação e/ou tamanho da refeição. Adicionando uma câmera para registrar o comportamento durante todo o ensaio, os pesquisadores podem determinar se as fêmeas não conseguem encontrar o Glytube, ou se encontram o Glytube, mas não se alimentam.
O ensaio aqui descrito pode ser adaptado para explorar muitas questões pendentes relacionadas ao comportamento alimentar em mosquitos. Por exemplo, a contribuição de proteínas sanguíneas específicas pode ser explorada alterando a proporção de proteínas constituintes ou concentração total de proteínas na refeição sanguínea artificial. Para avaliar os tamanhos das refeições de múltiplos eventos de alimentação, corantes com espectros distintos de fluorescência podem ser adicionados para diferenciar refeições de fontes únicas37. Este protocolo também pode ser modificado para estimular separadamente as partes bucais internas que detectam sangue e que são usadas para ingestão (ou seja, mais stylet), e os apêndices que entram em contato com a pele (ou seja, labium, pernas) como o mosquito pousa para iniciar a alimentação sanguínea36. Por exemplo, se os ligantes são adicionados diretamente à refeição, eles não entram em contato com o lábio e as pernas, uma vez que a membrana é perfurada apenas pelo estomado. Se os ligantes forem adicionados à superfície externa do parafilme, eles permanecem separados da refeição e podem ser contatados pelo lábio e pernas36. Finalmente, a cinética detalhada do comportamento de alimentação sanguínea não é bem compreendida e o método aqui apresentado poderia ser modificado para combinar rastreamento de alta resolução com ferramentas de aprendizado de máquina para extrair leituras comportamentais da locomoção, postura e dinâmica alimentar38.
Este protocolo visa ser fácil de usar e econômico, com a capacidade de atender pesquisadores que empregam manipulações farmacológicas e genéticas para estudar a alimentação sanguínea de mosquitos e o comportamento pós-alimentação sanguínea.

Apresentamos um protocolo para alimentação de farinhas de sangue modificadas aos mosquitos Aedes aegypti utilizando um alimentador de membrana artificial e medindo precisamente o volume da refeição consumida por cada mosquito individual. Este protocolo pode ser adaptado de forma flexível para alterar o conteúdo da refeição ou para comparar o volume de refeições consumido por diferentes grupos experimentais de mosquitos.
O mosquito A. aegypti ameaça a saúde global espalhando patógenos que causam doenças como febre amarela, dengue, chikungunya e Zika1,2,3,4,5. As fêmeas Ae. aegypti são obrigatórias alimentadores sanguíneos; eles devem consumir sangue vertebrado para obter a proteína necessária para o desenvolvimento de óvulos, e cada embreagem de ovos requer uma refeição sanguínea completa de pelo menos um hospedeiro6,7,8. A fêmea mosquito primeiro morde seu hospedeiro perfurando a pele com seu estilo e saliva injetadora, que contém compostos que desencadeiam a resposta imune do hospedeiro9. Ela então se alimenta bombeando sangue através de seu estote em seu midgut. Ao consumir uma refeição sanguínea de um hospedeiro infectado, ela pode ingerir patógenos transmitidos pelo sangue6,8, que depois migram do meio do mosquito para as glândulas salivares10. Mosquitos fêmeas infectadas dessa forma podem espalhar doenças injetando patógenos junto com saliva ao morder os hospedeiros subsequentes11,12. Compreender e quantificar os mecanismos de comportamento sanguíneo são passos cruciais no controle da transmissão de doenças transmitidas por mosquitos.
Muitos protocolos laboratoriais para criação e experimentação de mosquitos usam animais vivos, incluindo camundongos, cobaias ou humanos como fonte de sangue13,14,15,16. O uso de animais vivos impõe preocupações éticas, bem como requisitos complexos para formação de pessoal, moradia e cuidado de animais e cumprimento das políticas do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Também limita os tipos de compostos que podem ser entregues aos mosquitos, o que restringe os estudos que podem ser realizados17.
Aparelhos artificiais de alimentação sanguínea, que normalmente usam um sistema de membrana para simular a pele hospedeira, são ferramentas úteis para estudar comportamentos de alimentação sanguínea que contornam a necessidade de manutenção de hospedeiros vivos. O sangue inteiro pode ser comprado de vários fornecedores e alimentado com mosquitos usando alimentadores de membrana artificial aquecidos, reveses de água ou dispositivos similares18,19. Neste protocolo, demonstramos o uso de pequenos alimentadores de membrana descartáveis denominados "Glytubes". Este alimentador de membrana, publicado anteriormente por Costa-da-Silva et al. (2013)20, pode ser facilmente montado a partir de equipamentos de laboratório padrão, tornando-se ideal para fornecer refeições de sangue a um número moderado de mosquitos e simples de escalar para testar grupos maiores ou formulações múltiplas de refeições. O Glytube é uma alternativa barata e eficiente para outros alimentadores artificiais comerciais, que podem exigir maiores volumes de refeições e são mais adequados para alimentar grandes grupos de mosquitos em uma única formulação de refeição21.
Este protocolo inclui duas seções: preparar/entregar refeições artificiais e quantificar o consumo. Na primeira seção, os Glytubes são usados como um meio eficiente para fornecer dietas manipuladas. O sangue inteiro pode ser substituído por uma refeição inteiramente artificial para comparar os efeitos dos substitutos sanguíneos em vez de uma refeição de sangue. Uma receita adaptada de Kogan (1990)22 é apresentada aqui, embora várias formulações de refeições artificiais tenham sido desenvolvidas23,24. Além disso, a alimentação é um método menos invasivo e menos trabalhoso para introduzir compostos farmacológicos do que a injeção. Devido ao baixo volume total necessário para cada refeição (1-2 mL), este protocolo fornece um método de entrega atraente para reduzir as quantidades de reagentes caros. As fêmeas Ae. aegypti consomem prontamente refeições sem proteínas de solução salina com adenosina 5′-triphosphate (ATP)25,26, que fornece uma linha de base para medir os efeitos de componentes de refeição única. Por exemplo, o receptor semelhante ao Neuropeptide Y 7 (NPYLR7) no Ae. aegypti é conhecido por mediar a supressão em busca de hospedeiros após uma refeição sanguínea rica em proteínas, e quando os agonistas NPYLR7 são adicionados a uma refeição salina sem proteínas, mosquitos fêmeas exibem supressão em busca de hospedeiros semelhantes às que consumiram sangue inteiro7.
Na segunda seção, são apresentadas etapas para quantificar o volume de cada refeição consumida por um mosquito fêmea individualmente. Este ensaio é baseado em fluorescência e captura o estado de alimentação em maior resolução do que os métodos em que as fêmeas são classificadas como "alimentadas" ou "desapresas" com base apenas na avaliação visual da distensão abdominal. Adicionando fluoresceína à refeição antes da alimentação, os volumes de refeição ingeridos pelos indivíduos podem ser quantificados pela homogeneização de cada mosquito em um prato de 96 poços e medindo a intensidade da fluorescência como leitura. Este ensaio pode medir diferenças no vigor alimentar em resposta a variáveis como a composição da refeição ou o histórico genético dos mosquitos. A quantificação precisa é fundamental para tamanhos intermediários de refeições, por exemplo, quando as fêmeas são oferecidas refeições subótimas contendo impedimentos alimentares ou quando consomem refeições de sacarose de tamanhosvariáveis 27. Se os mosquitos alimentados forem necessários para ensaios comportamentais subsequentes após a quantificação do tamanho da refeição, o tamanho da refeição pode, em vez disso, ser calculado pesando fêmeas anestesiadas em grupos e estimando o aumento médio da massa por indivíduo. Embora menos precisa do que a marcação de fluoresceína, a pesagem ainda fornece uma estimativa agregada do volume da refeição e permite o exame do efeito da refeição em processos a jusante, como fecundidade ou atração subsequente do hospedeiro. Embora o tamanho da refeição sanguínea seja variável e possa ser influenciado por uma miríade de fatores11,28,29, tamanhos de refeição ingeridos medidos com os métodos descritos aqui são consistentes com quantificações anteriores7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Fêmeas de certas espécies de mosquitos podem espalhar doenças enquanto mordem hospedeiros de vertebrados para obter refeições de sangue ricas em proteínas necessárias para o desenvolvimento de óvulos. Em laboratório, os pesquisadores podem entregar refeições de sangue derivadas de animais e artificiais para mosquitos através de alimentadores de membrana, que permitem a manipulação da composição da refeição. Aqui, apresentamos métodos para alimentar sangue e farelos artificiais de sangue aos mosquitos Aedes aegypti e quantificar o volume consumido por fêmeas individuais.
A alimentação direcionada e a quantificação de refeições artificiais/sanguíneas têm usos amplos, incluindo testar os efeitos dos componentes da refeição no comportamento e na fisiologia dos mosquitos, fornecer compostos farmacológicos sem injeção e infectar mosquitos com patógenos específicos. Adicionar corante de fluoresceína à refeição antes da alimentação permite quantificação subsequente do tamanho da refeição. O volume da refeição consumido pelos mosquitos pode ser medido tanto em peso, se as fêmeas forem usadas posteriormente para experimentos comportamentais, ou homogeneizando fêmeas individuais em placas de 96 poços e medindo níveis de fluorescência usando um leitor de placas como um ensaio de ponto final. A quantificação do tamanho da refeição pode ser usada para determinar se a alteração dos componentes da refeição altera o volume da refeição ingerida ou se o consumo de refeições difere entre as cepas de mosquitos. A quantificação precisa do tamanho da refeição também é fundamental para ensaios a jusante, como aqueles efeitos de medição na atração do hospedeiro ou na fecundidade. Os métodos aqui apresentados podem ser ainda mais adaptados para acompanhar a digestão das refeições ao longo dos dias ou incluir múltiplos marcadores distinguíveis adicionados a diferentes refeições (como néctar e sangue) para quantificar o consumo de cada refeição por um único mosquito.
Esses métodos permitem que os pesquisadores realizem sozinhos medidas de alto rendimento para comparar o volume de refeições consumido por centenas de mosquitos individuais. Essas ferramentas serão, portanto, amplamente úteis à comunidade de pesquisadores de mosquitos para responder a diversas questões biológicas.

A Figura 1 apresenta um esquema para a montagem do Glytube, enquanto a Figura 2 mostra uma visão geral do design experimental para medir o tamanho da refeição usando o ensaio baseado em fluorescência descrito aqui. A Figura 3 fornece medidas representativas do tamanho da refeição fluoresceína de um experimento de alimentação sanguínea. A Figura 4, Figura 5e Figura 6 ilustram uma amostra de questões biológicas que podem ser abordadas por meio deste protocolo. As aplicações do protocolo são abrangentes e incluem alterar a composição da refeição sanguínea, alimentar compostos farmacológicos, quantificar precisamente refeições sanguíneas sub-ideais ou refeições menores de néctar, e comparar o comportamento alimentar entre os genótipos do mosquito.
Para gerar uma curva padrão para os cálculos do volume da refeição, as leituras de fluorescência são traçadas a partir dos poços de referência designados, cada um contendo um mosquito não pericido e um volume conhecido da refeição com fluoresceína de 0,002%(Figura 3A). As leituras de fluorescência dos demais poços, que contêm mosquitos do grupo controle negativo de mosquitos nãoofados ou do grupo experimental de mosquitos oferecidos por uma refeição, são comparadas a esta curva padrão para quantificar o volume da refeição (μL) consumido por cada mosquito(Figura 3B). Para validar as leituras da linha de base neste ensaio, deve-se confirmar que os mosquitos do grupo de controle negativo não são atribuídos a um valor positivo de μL consumido (Figura 3B, esquerda). Embora todas as fêmeas do grupo experimental tenham sido oferecidas a refeição sanguínea, alguns mosquitos alimentaram(Figura 3B, meio) e alguns não(Figura 3B, à direita). Este resultado demonstra que dois tipos de dados podem ser obtidos a partir deste protocolo: 1) o percentual do total de fêmeas que se alimentam de uma determinada refeição, e 2) o volume ingerido pelas fêmeas que se alimentam de uma determinada refeição.
Este protocolo pode ser usado para entregar e quantificar refeições com várias composições proteicas. Figura 4A,B mostram dados coletados usando refeições com fluoresceína adicionada. A proporção de mosquitos que alimentavam e o volume de refeição que ingeriam, respectivamente, foram calculados a partir das leituras de fluorescência. Essas leituras são altamente sensíveis e permitem quantificação precisa do μL, mas têm a limitação de que os mosquitos não podem ser usados para futuros experimentos ao vivo. A Figura 4C,D mostra dados coletados de um experimento independente com mosquitos que foram marcados como alimentados ou não alimentados por olho depois de serem oferecidos refeições sem fluoresceína. O tamanho da refeição foi calculado como peso médio/fêmea de grupos de 5 mosquitos. Embora essas medidas de peso sejam menos sensíveis do que as medidas de fluorescência, elas permitem que as fêmeas sejam recuperadas e usadas para mais experimentações ao vivo. A proporção de mosquitos que alimentam pode variar em diferentes dias experimentais, como refletido nas Figuras 4A e Figura 4C.
A Figura 5 mostra o volume consumido de refeições contendo drogas que regulam o comportamento de busca de mosquitos. Nesses experimentos, foram oferecidas refeições de sangue, soro fisiológico + ATP, ou soro fisiológico + ATP com 100 μM do agonista do receptor NPY Y2 humano, TM30338. Esta droga altera o comportamento de busca de hospedeiros através da ativação do receptor Ae. aegypti NPY 7. Medir o tamanho das refeições é fundamental para a interpretação dos experimentos para avaliar o efeito desta droga no comportamento pós-alimentação sanguínea, pois permite ao pesquisador calcular a dose consumida por cada fêmea.
Nos exemplos anteriores, as fêmeas eram alimentadas com sangue ou refeições sanguíneas substitutas, todas resultando em refeições de 3 a 5 μL(Figura 3, Figura 4, Figura 5). Este ensaio baseado em fluorescência também pode ser usado para medir tamanhos menores e/ou mais variáveis de refeição que não podem ser discernidos com precisão a partir de medidas médias de peso de grupo. Na Figura 6,o mesmo protocolo de quantificação da fluorescência foi utilizado para medir o comportamento de alimentação de néctar, trocando o Glytube por uma bola de algodão saturada com 10% de sacarose contendo fluoresceína de 0,002%. Os açúcares de néctar não podem ser apresentados no ensaio do Glytube porque as fêmeas não podem detectar a presença de açúcares de néctar com o estilo e não iniciar a alimentação27. Esses dados permitem ao pesquisador determinar que as refeições com açúcar são consistentemente menores do que as refeições de sangue, de acordo com o trabalho anterior34 (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Figura 1: Configuração do método Glytube usado para alimentar refeições com mosquitos. (A) Esquema de um Glytube desconstruído usado para alimentar sangue e outras refeições para mosquitos. (B) Esquema de um Glytube apresentado em cima de um recipiente de mosquitos com tampa de malha. Mosquitos fêmeas podem perfurar a tampa da malha para se alimentar. (C) Fotografias do Glytube (topo) e mosquitos fêmeas do Aedes aegypti antes, durante e depois da alimentação (inferior, da esquerda para a direita) em uma refeição entregue pelo Glytube. Mosquitos são mostrados perfurando através da malha cobrindo seu recipiente para acessar o alimentador de membrana. (D) Fotografias que mostram o aparecimento de mosquitos Ae. aegypti fêmeas que estão descidos (esquerda) e que têm engorgado em uma refeição de sangue artificial (direita, superior) ou uma refeição salina + ATP (direita, inferior). O método Glytube foi publicado anteriormente na Costa da Silva et al. (2013)20. Fotografias em (C) e (D) são cortesia de Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Figura 2: Esquema de como quantificar o tamanho da refeição após o protocolo de alimentação sanguínea do Glytube. (A) Os mosquitos são oferecidos uma refeição com fluoresceína (grupo superior, experimental) ou sem refeição (inferior, grupo de controle negativo não-preparado). (B) Mosquitos individuais são adicionados a uma placa de 96 poços após o término do experimento de alimentação. (C) A curva padrão é gerada utilizando quantidades conhecidas de refeição contendo fluoresceína de 0,002%. (D) Os mosquitos são homogeneizados para liberar qualquer fluoresceína consumida, e os níveis de fluorescência em cada poço são quantificados usando um leitor de placas. Este método de quantificação da fluorescência é modificado a partir de Liesch et al. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Figura 3: Experimento de alimentação sanguínea do Glytube com quantificação baseada em fluoresceína. (A) Medições de curvas padrão obtidas dos poços onde um mosquito do grupo de controle não-ofuscido foi adicionado a uma quantidade conhecida de refeição contendo fluoresceína de 0,002% (escala de eixo y = unidades arbitrárias). (B) Volume de refeição calculado utilizando leituras de fluorescência para fêmeas no grupo de controle não alimentado (esquerda, preto, n = 40), o grupo experimental que se alimentava de sangue (médio, vermelho, n = 37), e o grupo experimental que não se alimentava de sangue (direita, vermelho, n = 23). Cada ponto representa uma medida de uma fêmea individual. Os dados são mostrados como medianas com intervalo. As letras indicam grupos estatisticamente distintos, teste de Kruskal-Wallis com a comparação múltipla de Dunn, p<0,01. Esses dados foram publicados em Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Figura 4: Quantificação de refeições com composição proteica diferente. Foram oferecidas refeições de sangue de ovelha (vermelho), sangue artificial com proteínas sanguíneas humanas (Kogan (1990)22) (laranja), ou soro fisiológico livre de proteínas + refeição ATP (aqua)7. (A) Percentual de fêmeas alimentadas pontuadas com leituras de fluorescência. Cada ponto representa um grupo de 12 a 16 mulheres. Os dados são mostrados como medianas com intervalos, n = 12. (B) Volume de refeição calculado com leituras de fluorescência. Cada ponto representa uma medição de uma fêmea individual em um único ensaio da Figura 4A. Os dados são mostrados como medianas com intervalos, n = 12. (C) Percentual de fêmeas totalmente engorgadas após a alimentação artificial da membrana, pontuada pelo olho. Cada ponto representa a porcentagem de fêmeas engorgadas de grupos de 20 a 30 fêmeas. Os dados são mostrados como medianas com intervalos, n = 23. (D) Tamanhos de refeição pontuados como peso/mulher após o estado de alimentação foi marcado por olho. Os pesos foram calculados como a média de grupos de 5 mosquitos. Os dados são mostrados como medianas com intervalos, n = 23. A–D: As letras indicam grupos estatisticamente distintos, teste de Kruskal-Wallis com a comparação múltipla de Dunn, p<0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Figura 5: Quantificação de refeições com compostos farmacológicos. As fêmeas consomem refeições do mesmo tamanho de sangue de ovelha (vermelho), soro fisiológico + ATP (aqua) e soro fisiológico + ATP + 100 μM dose de agonista do receptor NPY Y2 humano TM30338 (azul escuro). Volume de refeição calculado com leituras de fluorescência. Cada ponto representa uma medida de uma fêmea individual. Os dados são mostrados como medianas com intervalos, n = 12. As letras indicam grupos estatisticamente distintos, teste de Kruskal-Wallis com a comparação múltipla de Dunn, p<0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Figura 6: Quantificação de refeições menores de néctar. (A) Esquema de ensaio de alimentação de néctar. (B) Volume de refeição calculado utilizando leituras de fluorescência para fêmeas do tipo selvagem ofereciam refeições de água (azul, n = 36) ou 10% de sacarose (verde, n = 53), cada uma com fluoresceína de 0,002%, no ensaio de alimentação de néctar. Cada ponto representa uma medida de uma fêmea individual. Os dados são mostrados como medianas com intervalos. As cartas indicam grupos estatisticamente distintos, teste de Mann-Whitney, p<0,05. Esses dados foram publicados em Jové et al. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Farinha de Sangue Artificial</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentração de Solução de Estoque (mg/mL)</td>
			<td>Volume de Solução de Estoque na Refeição (μL/mL)</td>
			<td>Concentração final da refeição (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Componentes proteicos*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globulinas</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemoglobina</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumina</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proteína Total</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Componentes não proteicos</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentração de Solução de Estoque (mM)</td>
			<td>Volume de Solução de Estoque na Refeição (μL/mL)</td>
			<td>Concentração final da refeição (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>Em estoque de γ-globulina</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>Em estoque de γ-globulina</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Os componentes proteicos são preparados em solução de estoque de água duplamente destilada, exceto para γ-Globulinas, que são dissolvidos em 400 mM NaHCO3 e incluem uma quantidade variável de NaCl (2-4%) no produto.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Receita para preparar refeições de sangue artificiais (adaptadas de Kogan (1990)22). O sangue artificial consiste em componentes proteicos e não proteicos regularmente encontrados no sangue humano e fornece a opção de variar as proporções desses componentes. Mosquitos podem produzir ovos depois de se alimentarem de sangue artificial7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Refeição salina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Concentração de Solução de Estoque (mM)</td>
			<td>Volume de Solução de Estoque na Refeição (μL/mL)</td>
			<td>Concentração final da refeição (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Receita para refeição salina com ATP (adaptado de Duvall et al. (2019)7). As refeições salinas sem proteínas podem ser usadas para fornecer compostos de interesse aos mosquitos enquanto ainda imitam a distensão abdominal que ocorre após a alimentação sanguínea, mas sem desencadear o desenvolvimento de óvulos que ocorre quando as proteínas são ingeridas.

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

O objetivo deste protocolo é entregar refeições de sangue derivadas de animais e artificiais aos mosquitos Aedes aegypti através de um alimentador de membrana artificial e quantificar precisamente o volume de refeições ingeridas.

Alimentação e quantificação de sangue derivados de animais e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.7K visualizações.  The Rockefeller University. O objetivo deste protocolo é entregar refeições de sangue derivadas de animais e artificiais aos mosquitos Aedes aegypti através de um alimentador de membrana artificial e quantificar precisamente o volume de refeições ingeridas.

Vídeo: Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Imunologia e Infecção

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

Alimentação e quantificação de sangue derivados de animais e refeições artificiais em mosquitos Aedes aegypti

Resumo

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Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Um Ensaio Bioluminescência Cálcio de análise funcional do Mosquito ( Aedes aegypti) E Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados à proteína

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra

Fluorescente

Aplicação Clínica de

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Pintura de cromossomo 2D e 3D em mosquitos da malária