Nous remercions Nipun Basrur, Adriana K. Rosas Villegas, Nadav Shai et Trevor Sorrells pour leurs commentaires sur les manuscrits, ainsi que Zhongyan Gong et Kyrollos Barsoum pour leur assistance technique. Nous remercions Alex Wild pour les photographies utilisées dans la figure 1. K.V. a été soutenu par la bourse Boehringer Ingelheim Fonds PhD. V.J. a été soutenu en partie par nih T32-MH095246. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention accordée à l’Université Rockefeller par le Howard Hughes Medical Institute par l’intermédiaire du programme de bourses James H. Gilliam pour l’étude avancée à V.J. Ce matériel est basé sur des travaux appuyés par le Programme de bourses d’études supérieures de la Fondation nationale des sciences dans le cadre de la subvention no. NSF DGE-1325261 à V.J. Les opinions, conclusions, conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour de nombreuses applications de laboratoire, les mangeoires à membrane artificielle offrent des avantages distincts par rapport aux hôtes vivants en permettant aux chercheurs de manipuler directement le contenu du repas. Bien que de multiples méthodes soient disponibles pour l’alimentation artificielle des membranes, la méthode décrite ici offre des avantages en termes de flexibilité, de coût et de débit. Par rapport à d’autres mangeoires à membrane commerciale, l’analyse Glytube nécessite un petit volume de repas, ce qui en fait un mécanisme efficace de livraison pour les réacgages coûteux, y compris les médicaments ou les agents pathogènes, en minimisant le volume totalrequis 7,35. Comme les repas salins et artificiels sans protéines favorisent l’engorgement, des composés ou des agents pathogènes peuvent être ajoutés à l’un ou l’autre repas comme alternative à haut débit et non invasive aux injections. En outre, chaque composant du Glytube peut facilement être lavé, remplacé ou mis à l’échelle pour livrer et quantifier plusieurs types de repas sans contamination croisée de l’appareil d’alimentation.
Pour quantifier les volumes de repas consommés par les moustiques, la méthode à base de fluorescence permet une quantification plus précise de la taille des repas que le pesage des moustiques avant et après l’alimentation. Il convient de noter que cette méthode est un test de fin de point. En revanche, la pesée permet de garder les moustiques en vie pour d’autres expérimentations. En utilisant un lecteur d’assiettes, la méthode à base de fluorescence peut être facilement mise à l’échelle pour la quantification à haut débit des repas consommés par des centaines de femelles individuelles.
Pour atteindre des taux d’alimentation élevés, une combinaison de signaux d’hôte suffisants doit être présente pour activer le comportement féminin à la recherche d’un hôte et attirer les femelles à la mangeoire. Si les moustiques ne s’entant pas sous le Glytube, le repas peut ne pas être bien réchauffé, ou la livraison de CO2 peut ne pas être suffisante. L’ajout d’odeur humaine à la surface de la membrane augmente de façon fiable l’attrait de la membrane artificielle. Si des moustiques sont observés sous le Glytube mais ne se nourrissent pas, la composition des repas peut être en faute. Les femelles peuvent ne pas se nourrir si le repas lui-même n’est pas chaud, le sang est trop vieux, ou si les additifs au repas sont intrinsèquement aversifs ou provoquent une réaction chimiqueindésirable 36. L’ATP supplémentaire augmente également de manière fiable les taux d’alimentation et peut être augmenté jusqu’à une concentration finale de 2 mM dans chacune des recettes fournies. Les femelles peuvent ne pas se nourrir si le parafilm n’est pas tendu à travers le bouchon Glytube; le parafilm doit être uniformément transparent et ne doit pas boucler, car cela empêche la femelle d’être en mesure de percer efficacement le parafilm avec son stylet. Si le repas fuit à travers le Glytube sur le maillage, le parafilm peut avoir déchiré pendant le processus d’étirement et doit être remplacé.
Changer la composition des repas peut également permettre aux chercheurs de manipuler la durée nécessaire pour effacer le repas à partir du mi-temps ainsi que le comportement ultérieur de recherche de l’hôte. Les repas présentés ici nécessitent 24-36 h pour la digestion7 semblable au sang d’origine animale. Après s’être nourries de l’un de ces repas, les femelles supprimeront la recherche d’hôtes pendant la fenêtre de temps de digestion. Comme le repas salin manque de protéines, les femelles retournent à la recherche d’un hôte après le repas. Si un retour plus rapide est souhaitable, les chercheurs peuvent choisir d’autres repas salins de « compensation rapide » qui sont excrétés en environ 6 h27. Alors que la composition du repas salin présenté ici est appariée pour comparer directement les résultats avec le repas de sang artificiel, le repas de « compensation rapide » correspond plus étroitement aux niveaux physiologiques de sel trouvés dans le sang vertébré.
Les méthodes décrites ici ont des limites qui devraient être prises en considération avant de choisir l’analyse qui convient le mieux aux objectifs expérimentaux du chercheur. Les mesures de fluorescéine décrites ne permettent pas aux moustiques d’être utilisés à nouveau pour des expérimentations supplémentaires. Cependant, des mesures de poids peuvent être prises avant la quantification de taille de repas utilisant l’essai de fluorescéine. Si le poids et la taille des repas sont cohérents dans plusieurs essais pour un repas donné, le poids peut être utilisé comme un proxy dans de futures expériences. En outre, ce protocole ne fait pas de distinction entre les déficits dans la recherche de l’hôte par rapport au comportement d’alimentation sanguine; les moustiques qui présentent des déficiences dans la recherche de la mangeoire membranaire auront une réduction des taux d’alimentation et /ou de la taille des repas. En ajoutant une caméra pour enregistrer le comportement tout au long de l’analyse, les chercheurs peuvent déterminer si les femelles ne peuvent pas trouver le Glytube, ou si elles trouvent le Glytube, mais ne se nourrissent pas.
L’analyse décrite ici peut être adaptée pour explorer de nombreuses questions en suspens liées au comportement alimentaire chez les moustiques. Par exemple, la contribution de protéines sanguines spécifiques peut être explorée en modifiant le rapport entre les protéines constituantes ou la concentration totale de protéines dans le farine de sang artificiel. Pour évaluer la taille des repas à partir de multiples événements d’alimentation, des colorants avec des spectres de fluorescence distincts peuvent être ajoutés pour différencier les repas des sourcesuniques 37. Ce protocole peut également être modifié pour stimuler séparément les parties buccales internes qui détectent le sang et qui sont utilisées pour l’ingestion (c.-à-d., stylet), et les appendices chimiosensoriels qui contactent la peau (c.-à-d. labium, jambes) pendant que le moustique atterrit pour commencerl’alimentation de sang 36. Par exemple, si des ligands sont ajoutés directement au repas, ils ne contactent pas le labium et les jambes, puisque la membrane n’est percée que par le stylet. Si des ligands sont ajoutés à la surface extérieure du parafilm à la place, ils restent séparés du repas et peuvent être contactés par le labium et les jambes36. Enfin, la cinétique détaillée du comportement d’alimentation du sang ne sont pas bien comprises et la méthode présentée ici pourrait être modifiée pour combiner le suivi à haute résolution avec des outils d’apprentissage automatique pour extraire les lectures comportementales de la locomotion, de la posture et de la dynamique del’alimentation 38.
Ce protocole vise à être convivial et rentable, avec la capacité de servir les chercheurs utilisant des manipulations pharmacologiques et génétiques pour étudier l’alimentation sanguine des moustiques et le comportement post-alimentation du sang.

Nous présentons un protocole pour l’alimentation des repas sanguins modifiés aux moustiques Aedes aegypti à l’aide d’une mangeoire à membrane artificielle et mesurant précisément le volume de repas consommé par chaque moustique individuel. Ce protocole peut être adapté avec souplesse pour modifier le contenu du repas ou pour comparer le volume de repas consommé par différents groupes expérimentaux de moustiques.
Le moustique Ae. aegypti menace la santé mondiale en propageant des agents pathogènes qui causent des maladies telles que la fièvre jaune, la dengue, le chikungunya et zika1,2,3,4,5. Ae. aegypti femelles sont obliger les mangeurs de sang; ils doivent consommer du sang vertébré pour obtenir la protéine nécessaire au développement des œufs, et chaque couvée d’œufs nécessite un repas sanguin complet d’au moinsun hôte 6,7,8. Le moustique femelle pique d’abord son hôte en perçant la peau avec son stylet et en injectant de la salive, qui contient des composés qui déclenchent la réponse immunitaire del’hôte 9. Elle se nourrit ensuite en pompant le sang à travers son stylet dans son midgut. Tout en consommant un repas de sang d’un hôte infecté, elle peut ingérer des agents pathogènestransmissibles par le sang 6,8, qui migrent ensuite de la médiane du moustique à ses glandes salivaires10. Les moustiques femelles infectés de cette façon peuvent propager la maladie en injectant des agents pathogènes ainsi que de la salive lorsqu’ils mordentles hôtes suivants 11,12. Comprendre et quantifier les mécanismes du comportement d’alimentation sanguine sont des étapes cruciales dans le contrôle de la transmission des maladies transmises par les moustiques.
De nombreux protocoles de laboratoire pour l’élevage et l’expérimentation des moustiques utilisent des animaux vivants, y compris des souris, des cobayes ou des humains comme source desang 13,14,15,16. L’utilisation d’animaux vivants impose des préoccupations éthiques ainsi que des exigences complexes en matière de formation du personnel, de logement et de soins aux animaux, et de conformité aux politiques du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC). Il limite également les types de composés qui peuvent être livrés aux moustiques, ce qui limite les études qui peuvent être menées17.
Les appareils artificiels d’alimentation sanguine, qui utilisent généralement un système membranaire pour simuler la peau de l’hôte, sont des outils utiles pour étudier les comportements d’alimentation sanguine qui contournent la nécessité de l’entretien des hôtes vivants. Le sang entier peut être acheté auprès d’un certain nombre de vendeurs et donné aux moustiques à l’aide de mangeoires à membrane artificielles chauffées et en vested’eau ou d’appareils similaires 18,19. Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de petites mangeoires membranaires jetables appelés « Glytubes ». Cette mangeoire membranaire, précédemment publiée par Costa-da-Silva et coll. (2013)20, peut être facilement assemblée à partir d’équipement de laboratoire standard, ce qui le rend idéal pour livrer des repas sanguins à un nombre modéré de moustiques et simple à mettre à l’échelle pour tester de plus grands groupes ou des formulations de repas multiples. Le Glytube est une alternative peu coûteuse et efficace à d’autres mangeoires artificielles commerciales, qui peuvent nécessiter de plus grands volumes de repas et sont plus appropriés pour l’alimentation par lots de grands groupes de moustiques sur une formulation de repasunique 21.
Ce protocole comprend deux sections : la préparation/livraison de repas artificiels et la quantification de la consommation. Dans la première section, les Glytubes sont utilisés comme un moyen efficace de fournir des régimes manipulés. Le sang entier peut être remplacé par un repas entièrement artificiel pour comparer les effets des substituts sanguins au lieu d’un repas sanguin. Une recette adaptée de Kogan (1990)22 est présentée ici, bien que plusieurs formulations artificielles de repasaient été développées 23,24. En outre, l’alimentation est une méthode moins invasive et moins laborieuse pour introduire des composés pharmacologiques que l’injection. En raison du faible volume total requis pour chaque repas (1-2 mL), ce protocole fournit une méthode de livraison attrayante pour réduire les quantités de reagents coûteux. Ae. aegypti femelles consomment facilement des repas sans protéines de solution saline avec adénosine 5′-triphosphate (ATP)25,26, qui fournit une base de référence pour mesurer les effets des composants de repas unique. Par exemple, neuropeptide Y-like récepteur 7 (NPYLR7) dans Ae. aegypti est connu pour médiation de l’hôte à la recherche de suppression après un repas de sang riche en protéines, et lorsque les agonistes NPYLR7 sont ajoutés à un repas salin sans protéines, les moustiques femelles présentent la suppression de recherche d’hôte similaire à ceux qui ont consommé du sang entier7.
Dans la deuxième section, des étapes pour quantifier le volume de chaque repas consommé par un moustique femelle individuel sont présentées. Cet essai est basé sur la fluorescence et capture l’état d’alimentation dans une résolution plus élevée que les méthodes dans lesquelles les femelles sont classées comme « nourries » ou « non nourries » sur la base de l’évaluation visuelle de la distension abdominale seule. En ajoutant de la fluorescéine au repas avant l’alimentation, les volumes de repas ingérés par les individus peuvent être quantifiés en homogénéisant chaque moustique dans une assiette de 96 puits et en mesurant l’intensité de la fluorescence en lecture. Cet essai peut mesurer les différences dans la vigueur de l’alimentation en réponse à des variables telles que la composition des repas ou le fond génétique des moustiques. Une quantification précise est essentielle pour les tailles de repas intermédiaires, par exemple lorsque les femelles se voient offrir des repas sous-optimaux contenant des moyens de dissuasion alimentaires ou lorsqu’elles consomment des repas au saccharose de tailles variables27. Si des moustiques nourris sont nécessaires pour des analyses comportementales ultérieures après la quantification de la taille des repas, la taille des repas peut plutôt être calculée en pesant les femelles anesthésiées en groupes et en estimant la masse moyenne accrue par individu. Bien que moins précis que le marquage à la fluorescéine, le pesage fournit toujours une estimation agrégée du volume des repas et permet d’examiner l’effet du repas sur les processus en aval, comme la fécondité ou l’attraction subséquente de l’hôte. Alors que la taille des farines sanguines est variable et peut être influencée par une myriadede facteurs 11,28,29, tailles de repas ingérées mesurées avec les méthodes décrites ici sont compatibles avec les quantificationsprécédentes 7,30,31.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

Les femelles de certaines espèces de moustiques peuvent propager des maladies tout en mordant les hôtes vertébrés pour obtenir des repas sanguins riches en protéines nécessaires au développement des œufs. En laboratoire, les chercheurs peuvent livrer des repas de sang artificiels et d’origine animale aux moustiques par l’intermédiaire de mangeoires membranaires, ce qui permet de manipulation de la composition des repas. Ici, nous présentons des méthodes pour nourrir le sang et les repas de sang artificiels aux moustiques Aedes aegypti et quantifier le volume consommé par les femelles individuelles.
L’alimentation ciblée et la quantification des repas artificiels/sanguins ont de larges utilisations, y compris l’essai des effets des composants de repas sur le comportement et la physiologie des moustiques, la livraison de composés pharmacologiques sans injection et l’infection des moustiques par des agents pathogènes spécifiques. L’ajout de colorant fluoréscéine au repas avant l’alimentation permet une quantification ultérieure de la taille des repas. Le volume de repas consommé par les moustiques peut être mesuré soit par le poids, si les femelles doivent être utilisées plus tard pour des expériences comportementales, soit par l’homogénéisation des femelles individuelles dans des assiettes de 96 puits et la mesure des niveaux de fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques comme test de point final. La quantification de la taille des repas peut être utilisée pour déterminer si le changement des composants des repas modifie le volume de repas ingéré ou si la consommation de repas diffère entre les souches de moustiques. La quantification précise de la taille des repas est également essentielle pour les analyses en aval, comme celles qui mesurent les effets sur l’attraction ou la fécondité de l’hôte. Les méthodes présentées ici peuvent être encore adaptées pour suivre la digestion des repas au fil des jours ou pour inclure de multiples marqueurs distinctifs ajoutés à différents repas (comme le nectar et le sang) pour quantifier la consommation de chaque repas par un seul moustique.
Ces méthodes permettent aux chercheurs d’effectuer à eux seul des mesures à haut débit pour comparer le volume de repas consommé par des centaines de moustiques individuels. Ces outils seront donc largement utiles à la communauté des chercheurs sur les moustiques pour répondre à diverses questions biologiques.

La figure 1 présente un schéma d’assemblage du Glytube, tandis que la figure 2 montre une vue d’ensemble de la conception expérimentale pour mesurer la taille des repas à l’aide de l’analyse à base de fluorescence décrite ici. La figure 3 fournit des mesures représentatives de la taille des farines de fluorescéine à partir d’une expérience d’alimentation sanguine. La figure 4, la figure 5 etla figure 6 illustrent un échantillon de questions biologiques qui peuvent être abordées à l’aide de ce protocole. Les applications du protocole sont de grande envergure et comprennent la modification de la composition des farines sanguines, l’alimentation des composés pharmacologiques, la quantification précise de repas sanguins sous-optimaux ou de petits repas nectariques, et la comparaison du comportement alimentaire entre les génotypes de moustiques.
Pour générer une courbe standard pour les calculs du volume des repas, des lectures de fluorescence sont tracées à partir des puits de référence désignés contenant chacun un moustique nonfed et un volume connu du repas avec 0,002 % de fluorescéine (figure 3A). Les relevés de fluorescence des puits restants, qui contiennent des moustiques du groupe témoin négatif des moustiques nonfed ou du groupe expérimental de moustiques offerts un repas, sont comparés à cette courbe standard pour quantifier le volume de repas (μL) consommé par chaque moustique (figure 3B). Pour valider les relevés de base de cet essai, il convient de confirmer que les moustiques du groupe témoin négatif nonfed ne se voient pas attribuer une valeur positive de μL consommée (figure 3B, gauche). Bien que toutes les femelles du groupe expérimental se soient vu offrir le repas sanguin, certains moustiques se sont nourris (figure 3B, milieu)et d’autres pas (figure 3B, à droite). Ce résultat démontre que deux types de données peuvent être obtenus à partir de ce protocole : 1) le pourcentage de femelles totales qui se nourrissent d’un repas donné, et 2) le volume ingéré par les femelles qui se nourrissent d’un repas donné.
Ce protocole peut être utilisé pour livrer et quantifier les repas avec diverses compositions protéiques. La figure 4A,B montre les données recueillies à l’aide de repas contenant de la fluorescéine ajoutée. La proportion de moustiques qui se nourrissaient et le volume de repas qu’ils ont ingéré, respectivement, ont été calculés à partir des lectures de fluorescence. Ces lectures sont très sensibles et permettent une quantification précise du μL, mais ont la limitation que les moustiques ne peuvent pas être utilisés pour de futures expériences vivantes. La figure 4C,D montre les données recueillies à partir d’une expérience indépendante avec des moustiques qui ont été marqués comme nourris ou non nourris par les yeux après qu’on leur a offert des repas sans fluorescéine. La taille des repas a été calculée comme poids moyen/femelle à partir de groupes de 5 moustiques. Bien que ces mesures de poids soient moins sensibles que les mesures de fluorescence, elles permettent aux femelles d’être récupérées et utilisées pour d’autres expériences vivantes. La proportion de moustiques qui se nourrissent peut varier d’un jour à l’autre, comme en témoignent la figure 4A et la figure 4C.
La figure 5 montre le volume consommé de repas contenant des médicaments qui régulent le comportement de recherche d’hôtes de moustiques. Dans ces expériences, les femelles ont été offertes sang, solution saline + ATP, ou saline + REPAS ATP avec 100 μM de l’agoniste récepteur humain NPY Y2, TM30338. Ce médicament modifie le comportement de recherche de l’hôte par l’activation d’Ae. aegypti NPY-like récepteur 7. La mesure de la taille des repas est essentielle à l’interprétation d’expériences pour évaluer l’effet de ce médicament sur le comportement post-alimentation sanguine, car il permet au chercheur de calculer la dose consommée par chaque femelle.
Dans les exemples précédents, les femelles étaient nourries soit de sang, soit de substituts sanguins, ce qui a donné lieu à des repas de 3 à 5 μL(figure 3, figure 4, figure 5). Cet essai à base de fluorescence peut également être utilisé pour mesurer des tailles de repas plus petites et/ou plus variables qui ne peuvent pas être discernées avec précision à partir des mesures moyennes du poids du groupe. À la figure 6, le même protocole de quantification par fluorescence a été utilisé pour mesurer le comportement d’alimentation du nectar en échangeant le Glytube contre une boule de coton saturée de saccharose à 10 % contenant de la fluorescéine à 0,002 %. Les sucres nectarifiques ne peuvent pas être présentés dans l’analyse de Glytube parce que les femelles ne peuvent pas détecter la présence de sucres nectarifiques avec le stylet et ne commencent pas à senourrir 27. Ces données permettent au chercheur de déterminer que les repas sucrés sont constamment plus petits que les repas sanguins, en accord avecles travaux antérieurs 34 (figure 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> Figure 1 : Mise en place de la méthode Glytube utilisée pour nourrir les moustiques. (A) Schéma d’un Glytube déconstruit utilisé pour nourrir le sang et d’autres repas aux moustiques. (B) Schéma d’un Glytube présenté au sommet d’un récipient de moustiques avec un couvercle en maille. Les moustiques femelles peuvent percer à travers le couvercle en maille pour se nourrir. (C) Photographies du Glytube (en haut) et des moustiques femelles Aedes aegypti avant, pendant et après l’alimentation (en bas, de gauche à droite) sur un repas livré par Glytube. Les moustiques sont montrés perçant à travers le maillage couvrant leur récipient pour accéder à la mangeoire membranaire. (D) Photographies montrant l’apparition de moustiques femelles Ae. aegypti qui ne sont pas fed (à gauche) et qui ont engorgé soit sur un repas de sang artificiel (à droite, en haut) ou un saline + repas ATP (droite, bas). La méthode Glytube a déjà été publiée dans Costa-da-Silva et coll. (2013)20. Les photographies dans (C) et (D) sont gracieuseté d’Alex Wild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> Figure 2 : Schéma de la façon de quantifier la taille des repas après le protocole d’alimentation sanguine de Glytube. (A) Les moustiques se voient offrir un repas avec de la fluorescéine (en haut, groupe expérimental) ou pas de repas (en bas, groupe témoin négatif nonfed). (B) Les moustiques individuels sont ajoutés à une plaque de 96 puits après la fin de l’expérience d’alimentation. (C) La courbe standard est générée à l’aide de quantités connues de farine contenant 0,002 % de fluorescéine. (D) Les moustiques sont homogénéisés pour libérer toute fluorescéine consommée, et les niveaux de fluorescence dans chaque puits sont quantifiés à l’aide d’un lecteur de plaques. Cette méthode de quantification par fluorescence est modifiée à partir de Liesch et coll. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> Figure 3 : Expérience d’alimentation sanguine de Glytube avec quantification à base de fluorescéine. (A) Mesures standard de la courbe obtenues à partir des puits où un moustique du groupe témoin nonfed a été ajouté à une quantité connue de repas contenant 0,002% de fluorescéine (échelle y-axe = unités arbitraires). (B) Volume des repas calculé à l’aide de lectures de fluorescence pour les femelles du groupe témoin non nourri (gauche, noir, n = 40), le groupe expérimental qui s’est nourri de sang (moyen, rouge, n = 37), et le groupe expérimental qui ne se nourrissait pas de sang (droite, rouge, n = 23). Chaque point représente une mesure d’une femelle individuelle. Les données sont indiquées comme médianes avec portée. Les lettres indiquent des groupes statistiquement distincts, test kruskal-wallis avec la comparaison multiple de Dunn, p<0.01. Ces données ont été publiées dans Jové et coll. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> Figure 4 : Quantification des repas dont la composition protéique diffère. Les femelles se sont vu offrir des repas de sang de mouton (rouge), de sang artificiel avec des protéines sanguines humaines (Kogan (1990)22) (orange), ou de farine saline sans protéines + ATP (aqua)7. (A) Pourcentage de femelles nourries à l’aide de lectures de fluorescence. Chaque point représente un groupe de 12 à 16 femelles. Les données sont indiquées sous forme de médianes avec des plages, n = 12. (B) Volume des repas calculé à l’aide de lectures de fluorescence. Chaque point représente une mesure d’une femme individuelle dans un seul essai de la figure 4A. Les données sont indiquées sous forme de médianes avec des plages, n = 12. (C) Pourcentage de femelles entièrement engorgées après l’alimentation artificielle de membrane, marqué par l’oeil. Chaque point représente le pourcentage de femmes engorgées de groupes de 20 à 30 femelles. Les données sont indiquées sous forme de médianes avec des plages, n = 23. ( D )Taillesdes repas marqués comme poids / femme après l’état d’alimentation a été marqué par l’œil. Les poids ont été calculés comme la moyenne des groupes de 5 moustiques. Les données sont indiquées sous forme de médianes avec des plages, n = 23. A–D: Les lettres indiquent des groupes statistiquement distincts, test kruskal-wallis avec la comparaison multiple de Dunn, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> Figure 5 : Quantification des repas avec des composés pharmacologiques. Les femelles consomment des repas de la même taille de sang de mouton (rouge), salin + ATP (aqua), et salin + ATP + 100 μM dose de npy humain récepteur Y2 agoniste TM30338 (bleu foncé). Volume des repas calculé à l’aide de lectures de fluorescence. Chaque point représente une mesure d’une femelle individuelle. Les données sont indiquées sous forme de médianes avec des plages, n = 12. Les lettres indiquent des groupes statistiquement distincts, test kruskal-wallis avec la comparaison multiple de Dunn, p<0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> Figure 6 : Quantification des petits repas nectarifs. (A) Schéma d’analyse d’alimentation au nectar. (B) Volume des repas calculé à l’aide de lectures de fluorescence pour les femelles de type sauvage offert des repas de l’eau (bleu, n = 36) ou 10% saccharose (vert, n = 53), chacun avec 0,002% de fluorescéine, dans l’analyse nectar-alimentation. Chaque point représente une mesure d’une femelle individuelle. Les données sont indiquées sous forme de médianes avec des plages. Les lettres indiquent des groupes statistiquement distincts, essai de Mann-Whitney, p<0.05. Ces données ont été publiées dans Jové et coll. (2020)27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Farine de sang artificiel</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentration de solution de stock (mg/mL)</td>
			<td>Volume de solution stock dans le repas (μL/mL)</td>
			<td>Concentration finale des repas (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Composants protéiques*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-Globulins</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hémoglobine</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Albumine</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protéines totales</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Composants non protéiques</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentration de stock solution (mM)</td>
			<td>Volume de solution stock dans le repas (μL/mL)</td>
			<td>Concentration finale des repas (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>En stock γ-globulin</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>En stock γ-globulin</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*Les composants protéiques sont préparés en solution de stock d’eau double distillée, à l’exception des γ-Globulines, qui sont dissoutes en NaHCO3 de 400 mM et comprennent une quantité variable de NaCl (2-4 %) dans le produit.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recette de préparation de repas de sang artificiel (adapté de Kogan (1990)22). Le sang artificiel se compose de protéines et de composants non protéiques que l’on trouve régulièrement dans le sang humain et offre la possibilité de varier les ratios de ces composants. Les moustiques peuvent produire des œufs après s’êtrenourris de sang artificiel 7,22.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Repas salin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Concentration de stock solution (mM)</td>
			<td>Volume de solution stock dans le repas (μL/mL)</td>
			<td>Concentration finale des repas (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Recette de repas salin avec ATP (adapté de Duvall et coll. (2019)7). Les repas salins sans protéines peuvent être utilisés pour fournir des composés d’intérêt aux moustiques tout en imitant la distension abdominale qui se produit après l’alimentation sanguine, mais sans déclencher le développement des œufs qui se produit lorsque les protéines sont ingérées.

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

L’objectif de ce protocole est de livrer des repas de sang artificiels et d’origine animale aux moustiques Aedes aegypti par l’intermédiaire d’une mangeoire à membrane artificielle et de quantifier avec précision le volume de repas ingérés.

Alimentation et quantification du sang d’origine animale et des repas artificiels chez les moustiques Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.6K vues.  The Rockefeller University. L’objectif de ce protocole est de livrer des repas de sang artificiels et d’origine animale aux moustiques Aedes aegypti par l’intermédiaire d’une mangeoire à membrane artificielle et de quantifier avec précision le volume de repas ingérés.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Appauvrissement des populations de cellules spécifiques par l&#39;épuisement Complément

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

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Immunologie et infection

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

L&#39;isolement des cellules de souris cavité péritonéale

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Un test de bioluminescence calcium pour l&#39;analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez (<emRhipicephalus> microplus) G récepteurs couplés aux protéines

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; sur les chromosomes mitotiques de moustiques

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).