نشكر نيبون باسرور، وأدريانا ك. روساس فيليغاس، ونداف شاي، وتريفور سوريلس على تعليقاتهم على المخطوطات، وزونغيان غونغ وكيرولوس بارسوم على المساعدة التقنية. نشكر أليكس وايلد على الصور المستخدمة في الشكل 1. وقد تم دعم ك. ف. من قبل زمالة PhD Boehringer Ingelheim Fonds. وقد تم دعم V.J. جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة T32-MH095246. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة لجامعة روكفلر من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال برنامج جيمس ه. جيليام للزمالات للدراسة المتقدمة إلى V.J. تستند هذه المادة إلى العمل المدعوم من قبل برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت المنحة رقم NSF DGE-1325261 إلى V.J. وأي آراء واستنتاجات واستنتاجات أو توصيات مُعرب عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة آراء المؤسسة الوطنية للعلوم.

<ol>
	<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li><li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue.">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li><li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus.">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+virus+infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias.">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history,+emergence,+biology,+and+prospects+for+control.">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes:+implications+for+anautogeny.">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li><li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting.">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li><li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti.">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li><li>Guerrero, D., Cantaert, T., Miss&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses.">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li><li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands.">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li><li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+(diptera:+Culicidae).">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li><li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission.">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li><li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li><li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia.">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li><li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti.">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li><li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans.">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li><li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus.">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li><li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka.">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).</li><li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glytube:+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).</li><li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil.">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li><li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+mosquitoes.">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+stimuli+and+artificial+feeding.">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+response+in+Aedes+aegypti:+stimulation+by+adenosine+triphosphate.">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li><li>Jov&#233;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li><li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity.">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li><li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako,+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+(ATSB).">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).</li><li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+(L.)+(Diperta:+Culicidae).">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li><li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope.">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+SkitoSnack,+an+artificial+blood+meal+replacement,+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota.">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior.">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).</li><li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet.">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li><li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact.">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li><li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector,+Aedes+aegypti,+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand.">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).</li><li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiteOscope,+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior.">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

بالنسبة للعديد من التطبيقات المختبرية، تقدم مغذيات الأغشية الاصطناعية فوائد متميزة مقارنة بالمضيفين المباشرين من خلال السماح للباحثين بالقدرة على التلاعب مباشرة بمحتويات الوجبة. على الرغم من أن هناك طرق متعددة متاحة لتغذية الغشاء الاصطناعي، فإن الطريقة الموصوفة هنا توفر مزايا في المرونة والتكلفة والإنتاجية. بالمقارنة مع غيرها من مغذيات الأغشية التجارية، والتهمة غليوب يتطلب حجم وجبة صغيرة، مما يجعلها آلية فعالة لتوصيل الكواشف مكلفة، بما في ذلك الأدوية أو مسببات الأمراض، عن طريق تقليل الحجم الإجمالي المطلوب7،35. وبما أن كل من الوجبات المالحة الخالية من البروتين ووجبات الدم الاصطناعية تعزز من الاحتقان، يمكن إضافة المركبات أو مسببات الأمراض إلى أي وجبة كبديل عالي الإنتاجية وغير جراحي للحقن. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة غسل كل مكون من مكونات Glytube أو استبداله أو توسيع نطاقه لتقديم وتحديد أنواع الوجبات المتعددة دون تلوث جهاز التغذية.
لتحديد حجم الوجبات التي يستهلكها البعوض ، تمكن الطريقة القائمة على الفلورسينس من تحديد حجم الوجبة أكثر دقة من وزن البعوض قبل وبعد التغذية. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة هي نقطة النهاية. في المقابل ، يسمح الوزن بإبقاء البعوض على قيد الحياة لمزيد من التجارب. باستخدام قارئ لوحة، يمكن بسهولة توسيع الطريقة القائمة على الفلورسينس للحصول على كمية عالية الإنتاجية من الوجبات التي تستهلكها مئات الإناث الفردية.
لتحقيق معدلات تغذية عالية، يجب أن يكون هناك مزيج من العظة المضيف كافية أن تكون موجودة لتنشيط سلوك الإناث المضيف تسعى وجذب الإناث إلى المغذية. إذا لم يزدحم البعوض تحت Glytube ، فقد لا يتم تسخين الوجبة بشكل صحيح ، أو قد لا تكون عملية توصيل ثاني أكسيد الكربون2 كافية. إضافة رائحة الإنسان إلى سطح الغشاء بشكل موثوق يزيد من جاذبية الغشاء الاصطناعي. إذا لوحظ البعوض تحت Glytube ولكن فشل في التغذية ، قد يكون تركيب الوجبة على خطأ. قد لا تتغذى الإناث إذا كانت الوجبة نفسها ليست دافئة، والدم قديمة جدا، أو إذا كانت إضافات إلى وجبة هي في جوهرها aversive أو تسبب تفاعلا كيميائيا غير مرغوب فيه36. يزيد ATP الإضافي أيضًا بشكل موثوق من معدلات التغذية ويمكن زيادته إلى تركيز نهائي 2 mM في كل من الوصفات المقدمة. الإناث قد لا تتغذى إذا لم يتم سحب البارا فيلم مشدود عبر غطاء غليتوب; وينبغي أن تكون شفافة بشكل موحد parafilm وينبغي عدم مشبك، وهذا يمنع الإناث من أن تكون قادرة على اختراق فعال parafilm مع stylet لها. إذا تسربت الوجبة من خلال Glytube على شبكة, قد تمزقت parafilm خلال عملية تمتد وينبغي استبدالها.
تغيير تكوين وجبة يمكن أيضا أن تسمح للباحثين للتلاعب طول الوقت اللازم لمسح وجبة من منتصف، فضلا عن السلوك اللاحقة المضيف البحث. وجبات الطعام المقدمة هنا تتطلب 24-36 ساعة للهضم7 مماثلة للدم المستمد من الحيوانات. بعد التغذية على أي من هذه الوجبات، وسوف الإناث قمع المضيف تسعى خلال فترة الهضم النافذة الزمنية. منذ وجبة المالحة تفتقر إلى البروتين، والإناث العودة إلى المضيف تسعى بعد مسح وجبة. إذا كان من المرغوب فيه عودة أسرع، يمكن للباحثين اختيار بديل "سريعة المقاصة" وجبات الملح التي تفرز في حوالي 6 ح27. في حين أن تكوين وجبة الملحية المعروضة هنا مطابق لمقارنة النتائج مباشرة مع وجبة الدم الاصطناعي ، فإن وجبة "المقاصة السريعة" تتطابق بشكل وثيق مع مستويات الملح الفسيولوجية الموجودة في الدم الفقاري.
الأساليب المذكورة هنا لها حدود يجب مراعاتها قبل اختيار الفحص الأكثر ملاءمة لأهداف الباحث التجريبية. ولا تسمح قياسات الفلورسين الموصوفة باستخدام البعوض مرة أخرى لإجراء تجارب إضافية. ومع ذلك، يمكن أن تؤخذ قياسات الوزن قبل كمية حجم وجبة باستخدام مقايسة الفلورسين. إذا كان الوزن وحجم الوجبة متسقين عبر تجارب متعددة لوجبة معينة، يمكن استخدام الوزن كوكيل في التجارب المستقبلية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول لا يميز بين العجز في سلوك البحث عن المضيفين مقابل التغذية بالدم؛ بل إنه لا يميز بين العجز في سلوك التغذية بالدم؛ بل إنه لا يميز بين العجز في سلوك التغذية بالدم؛ بل إنه لا يميز بين العجز في سلوك التغذية بالدم؛ بل إنه لا يُعَد في الواقع من الـ 1 البعوض الذي يظهر ضعف في العثور على تغذية الغشاء سيكون لها انخفاض في معدلات التغذية و / أو حجم وجبة. من خلال إضافة كاميرا لتسجيل السلوك في جميع أنحاء الفحص ، يمكن للباحثين تحديد ما إذا كانت الإناث لا تستطيع العثور على Glytube ، أو ما إذا كانت تجد Glytube ، ولكن لا تتغذى.
يمكن تكييف الفحص الموصوف هنا لاستكشاف العديد من الأسئلة المعلقة المتعلقة بسلوك التغذية في البعوض. على سبيل المثال، يمكن استكشاف مساهمة بروتينات الدم محددة عن طريق تغيير نسبة البروتينات المكونة أو تركيز البروتين الكلي في وجبة الدم الاصطناعي. لتقييم أحجام الوجبات من أحداث التغذية المتعددة ، يمكن إضافة الأصباغ مع أطياف الفلورانس المتميزة للتمييز بين الوجبات من مصادر فريدة37. ويمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول لتحفيز بشكل منفصل على الفم الداخلية التي تكشف عن الدم التي تستخدم للابتلاع (أي stylet)، والزوائد الكيميائية التي الاتصال الجلد (أي، اللافيوم والساقين) كما أراضي البعوض لبدء تغذية الدم36. على سبيل المثال ، إذا تم إضافة اليغاندات مباشرة إلى الوجبة ، فإنها لا تتصل باللبيوم والساقين ، حيث يتم ثقب الغشاء فقط من قبل النمط. إذا تم إضافة يغاندس إلى السطح الخارجي للبارا فيلم بدلا من ذلك، فإنها تبقى منفصلة عن وجبة ويمكن الاتصال بها من قبل labium والساقين36. وأخيرا ، فإن الحركية مفصلة من سلوك التغذية بالدم ليست مفهومة جيدا والأسلوب المعروض هنا يمكن تعديلها للجمع بين تتبع عالية الدقة مع أدوات التعلم الآلي لاستخراج قراءات السلوك من الحركة ، والموقف ، وديناميات التغذية38.
ويهدف هذا البروتوكول إلى أن يكون سهل الاستعمال وفعالا من حيث التكلفة، مع القدرة على خدمة الباحثين الذين يستخدمون التلاعب الدوائي والجيني لدراسة تغذية دم البعوض وسلوك ما بعد تغذية الدم.

نقدم بروتوكولًا لتغذية وجبات الدم المعدلة إلى بعوض Aedes aegypti باستخدام وحدة تغذية غشاء اصطناعي وقياس حجم الوجبات التي يستهلكها كل بعوضة على حدة على وجه التحديد. يمكن تكييف هذا البروتوكول بمرونة لتغيير محتوى الوجبة أو للمقارنة بين حجم الوجبة التي تستهلكها مجموعات تجريبية مختلفة من البعوض.
Ae. aegypti البعوض يهدد الصحة العالمية من خلال نشر مسببات الأمراض التي تسبب الأمراض بما في ذلك الحمى الصفراء, حمى الضنك, شيكونغونيا, وزيكا1,2,3,4,5. Ae. الإناث aegypti هي ملزمة مغذيات الدم; يجب أن تستهلك الدم الفقاريات للحصول على البروتين اللازم لتطوير البيض، وكل مخلب من البيض يتطلب وجبة الدم الكامل من مضيف واحد على الأقل6،7،8. تعض البعوضة الأنثوية مضيفها أولاً عن طريق ثقب الجلد مع لعابها وحقنه ، والذي يحتوي على مركبات تؤدي إلى استجابة المضيف المناعية9. ثم تتغذى عن طريق ضخ الدم من خلال نمط لها في منتصف لها. أثناء تناول وجبة دم من مضيف مصاب ، قد تبتلع مسببات الأمراض المنقولة بالدم6،8، والتي تهاجر بعد ذلك من منتصف البعوض إلى الغدد اللعابية10. يمكن البعوض الإناث المصابة بهذه الطريقة انتشار المرض عن طريق حقن مسببات الأمراض جنبا إلى جنب مع اللعاب عند عض المضيفين اللاحقة11,12. إن فهم وقياس آليات سلوك تغذية الدم هما خطوتان حاسمتان في مكافحة انتقال الأمراض المنقولة عن طريق البعوض.
العديد من البروتوكولات المختبرية لتربية البعوض والتجريب استخدام الحيوانات الحية بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية ، أو البشر كمصدر للدم13،14،15،16. يفرض استخدام الحيوانات الحية مخاوف أخلاقية ومتطلبات معقدة لتدريب الموظفين، والإسكان والرعاية الحيوانية، والامتثال لسياسات اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه( IACUC). كما أنه يحد من أنواع المركبات التي يمكن تسليمها إلى البعوض ، مما يحد من الدراسات التي يمكن إجراؤها17.
أجهزة تغذية الدم الاصطناعية، التي تستخدم عادة نظام الأغشية لمحاكاة الجلد المضيف، هي أدوات مفيدة لدراسة سلوكيات تغذية الدم التي تتحايل على الحاجة إلى الحفاظ على المضيفين الحية. يمكن شراء الدم الكامل من عدد من الباعة وتغذية البعوض باستخدام مغذيات غشاء اصطناعي ساخنة، والمياه سترة أو أجهزة مماثلة18،19. في هذا البروتوكول، نبرهن على استخدام مغذيات غشاء صغيرة يمكن التخلص منها يطلق عليها "غليوب". هذا الغشاء المغذي، التي نشرت سابقا من قبل كوستا دا سيلفا وآخرون (2013)20،يمكن تجميعها بسهولة من المعدات المختبرية القياسية، مما يجعلها مثالية لتقديم وجبات الدم لأعداد معتدلة من البعوض ومباشرة لتوسيع نطاق لاختبار مجموعات أكبر أو تركيبات وجبة متعددة. وGlytube هو بديل غير مكلفة وفعالة لغيرها من مغذيات اصطناعية تجارية، والتي قد تتطلب كميات أكبر وجبة وأكثر ملاءمة لدفعة تغذية مجموعات كبيرة من البعوض على صيغة وجبة واحدة21.
ويتضمن هذا البروتوكول قسمين: إعداد/تقديم وجبات اصطناعية وتحديد الاستهلاك كمياً. في القسم الأول، تستخدم Glytubes كوسيلة فعالة لتقديم الوجبات الغذائية التلاعب بها. يمكن استبدال الدم كله مع وجبة اصطناعية تماما لمقارنة آثار بدائل الدم بدلا من وجبة الدم. وصفة مقتبسة من كوغان (1990)22 وتقدم هنا, على الرغم من أن عدة تركيبات وجبة اصطناعية وقد وضعت23,24. وعلاوة على ذلك، فإن التغذية هي طريقة أقل غزواً وأقل جرأة لإدخال المركبات الدوائية من الحقن. نظرًا لانخفاض الحجم الإجمالي المطلوب لكل وجبة (1-2 مل)، يوفر هذا البروتوكول طريقة توصيل جذابة لتقليل كميات الكواشف باهظة الثمن. Ae. aegypti الإناث بسهولة تستهلك الوجبات خالية من البروتين من محلول ملحي مع أدينوسين 5′-ثلاثي الفوسفات (ATP)25,26, الذي يوفر خط الأساس لقياس آثار مكونات وجبة واحدة. على سبيل المثال ، Neuropeptide Y مثل مستقبلات 7 (NPYLR7) في Ae. ومن المعروف أن aegypti وساطة المضيف تسعى قمع بعد وجبة الدم الغنية بالبروتين ، وعندما تضاف NPYLR7 ناهضات إلى وجبة ملحية خالية من البروتين ، والإناث البعوض المعرض المضيف تسعى قمع مماثلة لتلك التي استهلكت الدم كله7.
وفي القسم الثاني، يتم عرض خطوات لتحديد حجم كل وجبة تستهلكها أنثى بعوضة فردية. هذا الفحص قائم على الفلور ويلتقط حالة التغذية بدقة أعلى من الطرق التي تصنف فيها الإناث على أنها "تغذية" أو "غير مغذية" استنادًا إلى التقييم البصري لارتض البطن وحده. بإضافة الفلوريسين إلى الوجبة قبل التغذية ، يمكن تحديد كميات الوجبات التي يتناولها الأفراد عن طريق تجانس كل بعوضة في طبق 96 بئرًا وقياس شدة الفلوراسك كمراء. ويمكن لهذه المقايسة أن تقيس الاختلافات في قوة التغذية استجابة لمتغيرات مثل تكوين الوجبات أو الخلفية الوراثية للبعوض. يعد التحديد الكمي الدقيق أمرًا حاسمًا لأحجام الوجبات الوسيطة ، على سبيل المثال عندما يتم تقديم وجبات دون المستوى الأمثل للإناث تحتوي على رادع غذائي أو عندما يستهلكن وجبات السكروز ذات الأحجام المتغيرة27. إذا كانت هناك حاجة إلى البعوض المغذّي للمقايسات السلوكية اللاحقة بعد تقدير حجم الوجبة ، فيمكن بدلاً من ذلك حساب حجم الوجبة عن طريق وزن الإناث المُجرّدات في مجموعات وتقدير متوسط زيادة الكتلة للفرد الواحد. على الرغم من أن أقل دقة من وضع علامات الفلورسين ، لا يزال الوزن يوفر تقديرًا مجمعًا لحجم الوجبة ويسمح بفحص تأثير الوجبة على عمليات المصب ، مثل البراز أو جاذبية المضيف اللاحقة. في حين أن حجم وجبة الدم متغير ويمكن أن يتأثر بعدد لا يحصى من العوامل11،28،29، فإن أحجام الوجبات المبتلعة تقاس بالطرق الموصوفة هنا تتفق مع القياسات الكمية السابقة7،30،31.

<table><tbody><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z143928</td><td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td></tr><tr><td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td><td>VWR</td><td>89009-668</td><td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>96-well black polystyrene plate</td><td>ThermoFisher</td><td>12-566-09</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate sealing film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>96-well PCR plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9621</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td><td>MilliporeSigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (human serum)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213</td><td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-911</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Bead mill homogenizer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Not required if using pellet pestle grinder</td></tr><tr><td>Cotton ball</td><td>Fisher Scientific</td><td>22456880</td><td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td></tr><tr><td>Defibrinated sheep blood</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DSB100</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Drosophila CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fly pad</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>MilliporeSigma</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence plate-reader</td><td>ThermoFisher</td><td>VL0000D0</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Gamma-globulin (human blood)</td><td>MilliporeSigma</td><td>H7379</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Hemoglobin (human)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G4386</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wrapping film - parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>90-691</td><td>Alternate magnetic stirrers can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 96-well plate</td><td>VWR</td><td>80094-180</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>MilliporeSigma</td><td>2236412</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Pellet pestle grinder</td><td>VWR</td><td>KT749521-1500</td><td>Not required if using bead mill homogenizer</td></tr><tr><td>Phosphate buffered solution (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-516F</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td></tr><tr><td>Rubber bands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>McMaster Carr</td><td></td><td>Needed if using a fly pad for CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; delivery</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stir bars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512</td><td>Alternate magnetic stir bars can be used</td></tr><tr><td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td><td></td><td></td><td>Example box used for feeding assays shown</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td>Alternate heating device may be used</td></tr><tr><td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td><td>American Home &amp;amp; Habit Inc.</td><td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td><td>Alternate options can be used</td></tr></tbody></table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

يمكن للإناث من أنواع البعوض معينة أن تنشر الأمراض أثناء عض المضيفين الفقاريات للحصول على وجبات الدم الغنية بالبروتين اللازمة لتطوير البيض. في المختبر، يمكن للباحثين تقديم وجبات الدم المشتقة من الحيوانات والاصطناعية للبعوض عن طريق مغذيات الأغشية، والتي تسمح بالتلاعب في تكوين الوجبات. هنا، نقدم طرقاً لتغذية الدم ووجبات الدم الاصطناعية إلى بعوض Aedes aegypti وتحديد الحجم الذي تستهلكه الإناث الفردية.
وللتغذية المستهدفة وتحديد كمي الوجبات الاصطناعية/الدم استخدامات واسعة النطاق، بما في ذلك اختبار آثار مكونات الوجبة على سلوك البعوض وعلم وظائف الأعضاء، وإيصال المركبات الدوائية دون حقن، وتصيب البعوض بمسببات محددة. إضافة صبغة الفلورسين إلى الوجبة قبل التغذية يسمح لحجم وجبة لاحقة. يمكن قياس حجم الوجبة التي يستهلكها البعوض إما بالوزن، إذا كان من المقرر استخدام الإناث في وقت لاحق للتجارب السلوكية، أو عن طريق تجانس الإناث الفردية في 96 بئرًا وقياس مستويات الفلوريسين باستخدام قارئ لوحة كمقايسة نقطة نهاية. يمكن استخدام القياس الكمي لحجم الوجبة لتحديد ما إذا كان تغيير مكونات الوجبة يغير حجم الوجبة أو إذا كان استهلاك الوجبة يختلف بين سلالات البعوض. كما أن القياس الكمي الدقيق لحجم الوجبة أمر بالغ الأهمية بالنسبة للمقايسات المصبية، مثل تلك التأثيرات على جاذبية المضيف أو البراز. يمكن تكييف الطرق المعروضة هنا لتتبع هضم الوجبات على مدار الأيام أو لتشمل علامات مميزة متعددة تضاف إلى وجبات مختلفة (مثل الرحيق والدم) لتحديد استهلاك كل وجبة من قبل بعوضة واحدة.
هذه الطرق تسمح للباحثين بإجراء قياسات عالية الإنتاجية بشكل فردي لمقارنة حجم الوجبات التي يستهلكها مئات البعوض الفردي. ولذلك، ستكون هذه الأدوات مفيدة على نطاق واسع لمجتمع الباحثين في مجال البعوض للإجابة على أسئلة بيولوجية متنوعة.

Watch this Scientific Journal Video about Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم وجبات الدم المشتقة من الحيوانات والاصطناعية إلى بعوض Aedes aegypti من خلال مغذي غشاء اصطناعي وتحديد حجم الوجبة التي يتم تناولها بدقة.

تغذية وقياس الدم المشتق من الحيوانات والوجبات الاصطناعية في البعوض Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.7K Views.  The Rockefeller University. الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم وجبات الدم المشتقة من الحيوانات والاصطناعية إلى بعوض Aedes aegypti من خلال مغذي غشاء اصطناعي وتحديد حجم الوجبة التي يتم تناولها بدقة.

Video: Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

بروتوكول للتربية البعوض (A. الغامبية)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Biology

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

دسرنا استنساخه Microinjection و "الحشري أوفيبوسيتيون" في البعوض والذباب البيت

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Environment

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

العدوى الفيروسية التجريبية في البعوض البالغ عن طريق التغذية الفموية والحقن المجهري

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

نظام غذائي خالي من الدم لخلفية البعوض الأنوفيلين

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

تحسين Fecundity والخصوبة المقايسة لAedes aegypti باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة البئر (لوحات EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

جرثومية عن طريق الفم الرضاعة مع البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life parameter data from genetically modified mosquitoes and comparing them to mosquitoes lacking transgenes from the same genetic background. This manuscript illustrates how to measure common life history traits in the mosquito Aedes aegypti, including fecundity, wing size and shape, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These parameters were chosen because they reflect reproductive success, are simple to measure, and are commonly reported in the literature. The representative results quantify fitness costs associated with either a gene knock-out or a single insertion of a gene drive element. Standardizing how life parameter data are collected is important because such data may be used to compare the health of transgenic mosquitoes generated across studies or to model the transgene fixation rate in a simulated wild-type mosquito population. Although this protocol is specific for transgenic Aedes aegypti, the protocol may also be used for other mosquito species or other experimental treatment conditions, with the caveat that certain biological contexts may require special adaptations.

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

The present protocol describes how to measure common life parameter data in Aedes aegypti mosquitoes, including fecundity, wing size, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These measurements can be used to assess the fitness of transgenic mosquitoes.

القياس الكمي لتكاليف اللياقة البدنية في بعوض الزاعجة المصرية المعدلة وراثيا

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...