니펀 바스루르, 아드리아나 K. 로사스 빌가스, 나다브 샤이, 트레버 소렐스에게 원고에 대한 의견을 전하고, 중얀 공과 키롤로스 바르소움에게 기술 지원을 부탁드립니다. 그림 1에사용된 사진에 대해 알렉스 와일드에게 감사드립니다. K.V.는 보링거 잉겔하임 폰드 박사 학위 펠로우십의 지원을 받았습니다. V.J.는 NIH T32-MH095246에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 작품은 V.J에 고급 연구 프로그램에 대한 제임스 H. 길리엄 펠로우십을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소에서 록펠러 대학에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 이 자료는 그랜트 번호에서 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원 되는 작업을 기반으로 합니다. NSF DGE-1325261에서 V.J. 이 자료에 표현된 의견, 사실 인정 및 결론 또는 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.

<ol>
	<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+and+burden+of+dengue.">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2014).</li><li>Rogers, D. J., Wilson, A. J., Hay, S. I., Graham, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+distribution+of+yellow+fever+and+dengue.">The global distribution of yellow fever and dengue.</a> Advances in Parasitology. 62 (05), 181-220 (2006).</li><li>Chouin-Carneiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibilities+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+from+the+Americas+to+Zika+virus.">Differential susceptibilities of Aedes aegypti and Aedes albopictus from the Americas to Zika virus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (3), (2016).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+virus+infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+first+confirmed+transmission+by+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+the+Amercias.">Outbreak of Zika virus infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and first confirmed transmission by Aedes aegypti mosquitoes in the Amercias.</a> Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Weaver, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+history,+emergence,+biology,+and+prospects+for+control.">Zika virus: history, emergence, biology, and prospects for control.</a> Antiviral Research. 130, 69-80 (2016).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+regulation+of+vitellogenesis+in+mosquitoes:+implications+for+anautogeny.">Nutritional regulation of vitellogenesis in mosquitoes: implications for anautogeny.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (7), 661-675 (2005).</li><li>Duvall, L. B., Ramos-Espiritu, L., Barsoum, K. E., Glickman, J. F., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+agonists+of+Ae.+aegypti+neuropeptide+Y+receptor+block+mosquito+biting.">Small-molecule agonists of Ae. aegypti neuropeptide Y receptor block mosquito biting.</a> Cell. 176 (4), 687-701 (2019).</li><li>Dimond, J. B., Lea, A. O., Hahnert, W. F., DeLong, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acids+required+for+egg+production+in+Aedes+aegypti.">The amino acids required for egg production in Aedes aegypti.</a> The Canadian Entomologist. 88 (2), 57-62 (1956).</li><li>Guerrero, D., Cantaert, T., Miss&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+mosquito+salivary+components+and+their+effect+on+the+immune+response+to+arboviruses.">Aedes mosquito salivary components and their effect on the immune response to arboviruses.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 1-11 (2020).</li><li>Raquin, V., Lambrechts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+replicates+and+accumulates+in+Aedes+aegypti+salivary+glands.">Dengue virus replicates and accumulates in Aedes aegypti salivary glands.</a> Virology. 507, 75-81 (2017).</li><li>Farjana, T., Tuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+blood+feeding+and+host-seeking+behavior+in+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+(diptera:+Culicidae).">Multiple blood feeding and host-seeking behavior in Aedes aegypti and Aedes albopictus (diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 50 (4), 838-846 (2013).</li><li>Scott, T. W., Takken, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+strategies+of+anthropophilic+mosquitoes+result+in+increased+risk+of+pathogen+transmission.">Feeding strategies of anthropophilic mosquitoes result in increased risk of pathogen transmission.</a> Trends in Parasitology. 28 (3), 114-121 (2012).</li><li>Ross, P. A., Lau, M. J., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+membrane+feeding+compromise+the+quality+of+Aedes+aegypti+mosquitoes.">Does membrane feeding compromise the quality of Aedes aegypti mosquitoes.</a> PLoS ONE. 14 (11), 1-19 (2019).</li><li>Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+Aedes+aegypti+mosquitoes+infected+with+wolbachia.">Maintaining Aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia.</a> Journal of Visualized Experiments. 2017 (126), 1-8 (2017).</li><li>Briegel, H., Hefti, M., DiMarco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+during+sequential+gonotrophic+cycles+in+large+and+small+female+Aedes+aegypti.">Lipid metabolism during sequential gonotrophic cycles in large and small female Aedes aegypti.</a> Journal of Insect Physiology. 48 (5), 547-554 (2002).</li><li>McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A. S., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+integration+of+carbon+dioxide+and+other+sensory+cues+drives+mosquito+attraction+to+humans.">Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans.</a> Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).</li><li>Pakes, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).</li><li>Deng, L., Koou, S. Y., Png, A. B., Ng, L. C., Lam-Phua, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mosquito+feeding+system+for+routine+blood-feeding+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus.">A novel mosquito feeding system for routine blood-feeding of Aedes aegypti and Aedes albopictus.</a> Tropical Biomedicine. 29 (1), 169-174 (2012).</li><li>Gunathilaka, N., Ranathunge, T., Udayanga, L., Abeyewickreme, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+blood+sources+and+artificial+blood+feeding+methods+in+rearing+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+for+sterile+insect+technique+and+incompatible+insect+technique+approaches+in+Sri+Lanka.">Efficacy of blood sources and artificial blood feeding methods in rearing of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) for sterile insect technique and incompatible insect technique approaches in Sri Lanka.</a> BioMed Research International. 2017, 3196924 (2017).</li><li>Costa-da-Silva, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glytube:+a+conical+tube+and+parafilm+M-based+method+as+a+simplified+device+to+artificially+blood-feed+the+Dengue+vector+mosquito,+Aedes+aegypti.">Glytube: a conical tube and parafilm M-based method as a simplified device to artificially blood-feed the Dengue vector mosquito, Aedes aegypti.</a> PLoS ONE. 8 (1), 53816 (2013).</li><li>Carvalho, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+genetically+modified+Aedes+aegypti+for+field+releases+in+Brazil.">Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil.</a> Journal of Visualized Experiments. 83 (83), 1-10 (2014).</li><li>Kogan, P. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitute+blood+meal+for+investigating+and+maintaining+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 27 (4), 1-4 (1990).</li><li>Gonzales, K. K., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+mosquitoes.">Artificial diets for mosquitoes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), (2016).</li><li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes.">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), 0006142 (2017).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+stimuli+and+artificial+feeding.">Feeding stimuli and artificial feeding.</a> Bulletin of the World Health Organization. 36, 590-593 (1967).</li><li>Galun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeding+response+in+Aedes+aegypti:+stimulation+by+adenosine+triphosphate.">Feeding response in Aedes aegypti: stimulation by adenosine triphosphate.</a> Science. 142, 1674-1675 (1963).</li><li>Jov&#233;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+Discrimination+of+Blood+and+Floral+Nectar+by+Aedes+aegypti+Mosquitoes.">Sensory Discrimination of Blood and Floral Nectar by Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Neuron. 108, 1-18 (2020).</li><li>Petersen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+age+of+first+blood+meal+and+Zika+virus+infection+on+Aedes+aegypti+egg+production+and+longevity.">The impact of the age of first blood meal and Zika virus infection on Aedes aegypti egg production and longevity.</a> PLoS ONE. 13 (7), 1-15 (2018).</li><li>Sissoko, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+sugar+feeding+behavior+by+Aedes+aegypti+in+Bamako,+Mali+makes+them+ideal+candidates+for+control+with+Attractive+Toxic+Sugar+Baits+(ATSB).">Frequent sugar feeding behavior by Aedes aegypti in Bamako, Mali makes them ideal candidates for control with Attractive Toxic Sugar Baits (ATSB).</a> PLoS ONE. 14 (6), 0214170 (2019).</li><li>Houseman, J. G., Downe, A. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+measuring+blood+meal+size+and+proteinase+activity+for+determining+the+effects+of+mated+state+of+digestive+processes+of+female+Aedes+aegypti+(L.)+(Diperta:+Culicidae).">Methods of measuring blood meal size and proteinase activity for determining the effects of mated state of digestive processes of female Aedes aegypti (L.) (Diperta: Culicidae).</a> The Canadian Entomologist. 18, 241-248 (1986).</li><li>Redington, B. C., Hockmeyer, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+estimating+blood+meal+volume+in+Aedes+aegypti+using+a+radioisotope.">A method for estimating blood meal volume in Aedes aegypti using a radioisotope.</a> Journal of Insect Physiology. 22 (7), 961-966 (1976).</li><li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+SkitoSnack,+an+artificial+blood+meal+replacement,+on+Aedes+aegypti+life+history+traits+and+gut+microbiota.">The effect of SkitoSnack, an artificial blood meal replacement, on Aedes aegypti life history traits and gut microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+regulation+of+mosquito+reproductive+behavior.">The endogenous regulation of mosquito reproductive behavior.</a> Experientia. 46 (7), 660-670 (1990).</li><li>Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+genetic+characterization+of+neuropeptide+Y-like+receptors+in+Aedes+aegypti.">Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 22486 (2013).</li><li>Frances, S. P., Sithiprasasna, R., Linthicum, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+evaluation+of+the+response+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+uninfected+and+infected+with+Dengue+virus+to+Deet.">Laboratory evaluation of the response of Aedes aegypti and Aedes albopictus uninfected and infected with Dengue virus to Deet.</a> Journal of Medical Entomology. 48 (2), (2011).</li><li>Dennis, E. J., Goldman, O. V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+mosquitoes+use+their+legs+to+sense+DEET+on+contact.">Aedes aegypti mosquitoes use their legs to sense DEET on contact.</a> Current Biology. 29 (9), 1551-1556 (2019).</li><li>Harrington, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+feeding+patterns+of+the+Dengue+vector,+Aedes+aegypti,+on+individual+human+hosts+in+rural+Thailand.">Heterogeneous feeding patterns of the Dengue vector, Aedes aegypti, on individual human hosts in rural Thailand.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (8), 3048 (2014).</li><li>Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiteOscope,+an+open+platform+to+study+mosquito+biting+behavior.">BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior.</a> eLife. 9, 1-24 (2020).</li></ol>

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많은 실험실 응용 분야에서 인공 멤브레인 피더는 연구원이 식사 내용을 직접 조작 할 수있는 능력을 허용함으로써 라이브 호스트에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다. 인공 멤브레인 공급에 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만, 여기에 설명 된 방법은 유연성, 비용 및 처리량의 장점을 제공합니다. 다른 상용 멤브레인 피더와 비교하여 Glytube 분석법은 소량의 식사 량이 필요하며, 약물이나 병원균을 포함한 비용이 많이 드는 시약에 대한 효율적인 전달 메커니즘으로7,35에필요한총 부피를 최소화한다. 단백질이 없는 식염수와 인공 혈액 식사가 모두 포진을 촉진하기 때문에 화합물 이나 병원균은 주사에 대한 높은 처리량 및 비 침습적 대안으로 어느 식사에 첨가 될 수 있습니다. 또한, 글리튜브의 각 성분은 쉽게 세척, 교체 또는 스케일업하여 수유 장치의 교차 오염 없이 여러 식사 유형을 전달하고 정량화할 수 있다.
모기에 의해 소비되는 식사 량을 정량화하기 위하여는, 형광 기지를 둔 방법은 먹이기 전후에 모기를 무게보다는 더 정확한 식사 크기 정량화를 가능하게 합니다. 이 방법은 엔드 포인트 분석이라는 점에 유의해야 합니다. 대조적으로, 계량은 추가 실험을 위해 모기를 살아 있게 할 수 있게 합니다. 플레이트 판독기를 사용하여, 형광 계 의 방법은 개별 여성의 수백에 의해 소비 식사의 높은 처리량 정량화를 위해 쉽게 확장 될 수있다.
높은 공급 비율을 달성하기 위해, 충분한 호스트 단서의 조합은 여성 호스트 추구 행동을 활성화하고 피더에 여성을 유치하기 위해 존재해야합니다. 글리튜브 아래에 모기가 몰려들어 있지 않으면 식사가 제대로 따뜻해지지 않거나 CO2 배달이 충분하지 않을 수 있습니다. 막 표면에 인간의 냄새를 첨가하여 인공 막의 매력을 안정적으로 증가시킵니다. 글리튜브 아래에서 모기가 관찰되지만 먹이지 못하면 식사 구성이 잘못될 수 있습니다. 식사 자체가 따뜻하지 않거나, 혈액이 너무 오래되거나, 식사에 첨가제가 본질적으로 역경적이거나 바람직하지 않은 화학 반응을 유발하는 경우 여성은 먹이를 하지 않을 수있습니다(36). 추가 ATP는 또한 안정적으로 공급 속도를 증가시키고 제공된 각 조리법에서 2mM의 최종 농도까지 확장 될 수 있습니다. 여성은 파라필름이 글리튜브 캡을 가로질러 팽팽하게 당기지 않으면 먹이를 줄 수 없습니다. 파라필름은 균일하게 투명해야 하며, 여성이 파라필름을 스타일으로 효과적으로 관통할 수 없도록 하기 때문에 버클해서는 안 됩니다. 식사가 글리튜브를 통해 메쉬로 누출되는 경우, 파라필름은 스트레칭 과정에서 찢어졌을 수 있으며 교체해야 합니다.
식사 구성을 변경하면 연구원은 미드구트에서 식사를 지우는 데 필요한 시간의 길이뿐만 아니라 후속 호스트 추구 행동을 조작 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 식사는 동물 유래 혈액과 유사한 소화7을 위해 24-36 h가 필요합니다. 이러한 식사 중 어느 한 식에도 먹이 후, 여성은 소화 시간 창 동안 호스트 추구를 억제 합니다. 식염수 식사는 단백질이 부족하기 때문에, 여성은 식사가 지워진 후 호스트 찾기로 돌아갑니다. 빠른 반환이 바람직한 경우, 연구원은 약 6 시간27에서배설되는 대체 "빠른 청산"식염수 식사를 선택할 수 있습니다. 여기에 제시 된 식염수 식사의 구성은 인공 혈액 식사와 직접 결과를 비교하기 위해 일치하지만, "빠른 지우기"식사는 척추 동물 혈액에서 발견되는 생리적 소금 수준과 더 밀접하게 일치합니다.
여기에 설명된 방법은 연구원의 실험 목표에 가장 적합한 분석법을 선택하기 전에 고려해야 할 한계가 있습니다. 설명된 형광량 측정은 추가 실험을 위해 모기를 다시 사용하는 것을 허용하지 않습니다. 그러나, 형광분석기를 이용하여 식사 크기 정량화 전에 중량 측정을 할 수 있다. 주어진 식사에 대 한 여러 실험에 걸쳐 무게와 식사 크기는 일관 된 경우, 무게는 향후 실험에서 프록시로 사용할 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 호스트 추구에 있는 적자 대 혈액 공급 행동 사이에서 구별하지 않습니다; 막 피더를 찾는 데 장애를 보이는 모기는 수유 율 및 /또는 식사 크기가 감소할 것입니다. 분석 전반에 걸쳐 행동을 기록하는 카메라를 추가함으로써 연구자들은 여성이 Glytube를 찾을 수 있는지 또는 글리튜브를 찾을 수 있는지 여부를 결정할 수 있지만 먹이를 제공하지 는 않습니다.
여기에 설명된 분석체는 모기의 먹이 행동과 관련된 많은 뛰어난 질문을 탐구하기 위해 적응할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 혈액 단백질의 기여는 인공 혈액 식사에서 구성 단백질 또는 총 단백질 농도의 비율을 변경하여 탐구될 수 있다. 여러 먹이 이벤트에서 식사 크기를 평가하기 위해, 독특한 소스(37)에서식사를 차별화하기 위해 뚜렷한 형광 스펙트럼염료를 추가 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 혈액을 검출하고 섭취(즉, stylet)에 사용되는 내부 구강 부와 모기가 혈액을먹이기 시작하는 모기 대지(즉, 라듐, 다리)에 접촉하는 화학 감각 부속물을 별도로 자극하도록 수정될 수 있다. 예를 들어, 리간드가 식사에 직접 첨가되는 경우 멤브레인이 스타일에 의해서만 관통되기 때문에 라비움과 다리에 접촉하지 않습니다. 리간드가 파라필름의 바깥쪽에 첨가되면, 그(것)들은 식사에서 분리된 남아 있고 라듐과 다리에 의해 접촉될 수 있습니다(36). 마지막으로, 혈액 공급 행동의 상세한 운동은 잘 이해되지 않으며 여기에 제시된 방법은 운동, 자세 및 공급 역학의 행동 판독을 추출하기 위해 기계 학습 도구와 고해상도 추적을 결합하도록 수정될 수 있다38.
이 프로토콜은 모기 혈액 공급 및 혈액 먹이 후 행동을 연구하기 위해 약리학 및 유전 조작을 사용하는 연구원에게 서비스를 제공하는 능력으로 사용자 친화적이고 비용 효율적이기 위한 것입니다.

우리는 인공 막 피더를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 수정 된 혈액 식사를 공급하고 각 개별 모기가 소비하는 식사 량을 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 식사의 내용을 변경하거나 모기의 다른 실험 단에 의해 소모된 식사 양을 비교하기 위하여 유연하게 적응될 수 있습니다.
Ae. aegypti 모기는 황열병, 뎅기열, 치쿤구냐 및지카1,2,3,4,5를포함하여 질병을 일으키는 원인이 되는 병원균을 퍼감으로써 글로벌 건강을 위협합니다. Ae. aegypti 여성은 혈액 공급자입니다. 그들은 계란 발달에 필요한 단백질을 얻기 위해 척추 동물 혈액을 소비해야하며, 계란의 각 클러치는 적어도 하나의 호스트6,7,8에서전체 혈액 식사를 필요로한다. 암컷 모기는 먼저 그녀의 스타일로 피부를 관통하고 타액을 주입하여 호스트에게 물린데, 이는 호스트의 면역 반응을 유발하는 화합물을 함유하고있습니다 9. 그런 다음 그녀는 그녀의 midgut에 그녀의 스타일을 통해 혈액을 펌핑하여 공급. 감염된 호스트에게서 혈액 식사를 소모하는 동안, 그녀는 그 때 그녀의 타액 선지로 모기의 midgut에서 이동하는 혈액 매개 병원체6,8을섭취할 수 있습니다10. 이러한 방식으로 감염된 여성 모기는 후속숙주(11,12)를물릴 때 타액과 함께 병원균을 주입하여 질병을 확산시킬 수 있다. 혈액 공급 행동의 메커니즘을 이해하고 정량화하는 것은 모기 매개 질병의 전염을 통제하는 중요한 단계입니다.
모기 사육 및 실험을 위한 많은 실험실 프로토콜은 마우스, 기니피그 또는 인간을 포함한 살아있는 동물을 혈액원13,14,15,16으로사용한다. 살아있는 동물의 사용은 윤리적 우려뿐만 아니라 인사 훈련, 동물 주거 및 관리에 대한 복잡한 요구 사항, 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 정책을 준수합니다. 또한 모기에 전달 될 수 있는 화합물의 종류를 제한, 수행 될 수 있는 연구를 제한17.
일반적으로 호스트 피부를 시뮬레이션하기 위해 멤브레인 시스템을 사용하는 인공 혈액 공급 장치는 살아있는 호스트의 유지 보수의 필요성을 우회하는 혈액 공급 행동을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 전혈은 여러 공급 업체에서 구입하고 가열, 물 자켓 인공 멤브레인 피더 또는 유사한 장치를 사용하여 모기에 공급 할 수 있습니다18,19. 이 프로토콜에서는 "글리튜브"라고 불리는 작은 일회용 멤브레인 피더의 사용을 보여줍니다. 이전에 코스타 다 실바 외(2013)20에의해 간행된 이 멤브레인 피더는 표준 실험실 장비에서 쉽게 조립될 수 있어, 적당한 수의 모기에게 혈액 식사를 전달하고 더 큰 그룹 또는 다중 식사 제제를 테스트하기 위해 간단하게 확장할 수 있습니다. 글리튜브는 다른 상업용 인공 피더에 대한 저렴하고 효율적인 대안으로, 더 큰 식사 량이 필요할 수 있으며 단일 식사제형(21)에대규모 모기 그룹을 일괄 공급하는 데 더 적합합니다.
이 프로토콜에는 인공 식사 준비/제공 및 소비 정량화의 두 섹션이 포함되어 있습니다. 첫 번째 섹션에서 Glytube는 조작 된 식단을 제공하는 효율적인 수단으로 사용됩니다. 전혈은 혈액 식사 대신 혈액 대체물의 효과를 비교하기 위해 완전히 인공 식사로 대체 될 수 있습니다. 여러 인공 식사 공식이 개발되었지만 Kogan (1990)22에서 적응 된 조리법이 여기에 제시된다23,24. 또한, 수유는 주입보다 약리학적 화합물을 도입하는 덜 침습적이고 덜 힘든 방법입니다. 이 프로토콜은 각 식사(1-2mL)에 필요한 총 부피수가 적기 때문에 고가의 시약의 양을 줄이는 매력적인 전달 방법을 제공합니다. Ae. aegypti 여성은 아데노신 5′-triphosphate (ATP)25,26을사용하여 식염수 용액의 단백질이 없는 식사를 쉽게 섭취하며, 이는 단일 식사 구성 요소의 효과를 측정하기위한 기준을 제공합니다. 예를 들어, Ae. aegypti의 Neuropeptide Y-like receptor 7(NPYLR7)은 단백질이 풍부한 혈액 식사 후 숙주 추구 억제를 중재하는 것으로 알려져 있으며, NPYLR7 작용제가 단백질이 없는 식염수 식사에 첨가되면 여성 모기는 전체 혈액7을소비한 것과 유사한 호스트 를 찾는 억제를 나타낸다.
두 번째 섹션에서는 개별 여성 모기가 소비하는 각 식사의 양을 정량화하는 단계가 제시됩니다. 이 분석법은 형광에 기반을 두고 있으며 여성이 복부 팽만성에 대한 시각적 평가에 기초하여 "먹이" 또는 "fed"로 분류되는 방법보다 더 높은 해상도의 수유 상태를 캡처합니다. 먹이주기 전에 식사에 형광을 첨가함으로써 개인이 섭취한 식사 량은 각 모기를 96웰 플레이트에 균질화하고 형광 강도를 판독제로 측정하여 정량화될 수 있습니다. 이 분석은 식사 구성 또는 모기의 유전 배경과 같은 변수에 대한 응답으로 활력을 먹이기의 차이를 측정 할 수 있습니다. 정확한 정량화는 중간 식사 크기에 대 한 중요 한, 예를 들어 여성이 먹이 억제를 포함 하는 최적이 아닌 식사를 제공 하는 경우 또는 그들은 변수 크기의 자당 식사를 소비 하는 경우(27). 식사 크기 정량화 후 후속 행동 적 측정에 필요한 경우, 식사 크기는 대신 그룹에서 마취 된 여성을 무게와 개인 당 평균 증가 질량을 추정하여 계산 할 수 있습니다. 형광 표시보다 덜 정확하지만 계량은 여전히 식사 량의 집계 된 추정을 제공하고 fecundity 또는 후속 호스트 매력과 같은 다운 스트림 프로세스에 대한 식사의 영향을 검사 할 수 있습니다. 혈액 식사 크기는 가변적이고 무수한요인(11,28,29)에의해 영향을 받을 수 있지만, 여기에 기재된 방법으로 측정된 섭취식 크기는 이전 정량화7,30,31과일치한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-70C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Z143928</td>
			<td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89009-668</td>
			<td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black polystyrene plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-566-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plate sealing film</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSP9621</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A6419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (human serum)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>A9511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213</td>
			<td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-911</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead mill homogenizer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Not required if using pellet pestle grinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22456880</td>
			<td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DSB100</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila CO2 fly pad</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F6377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence plate-reader</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>VL0000D0</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-globulin (human blood)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H7379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemoglobin (human)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film - parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>90-691</td>
			<td>Alternate magnetic stirrers can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge for 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80094-180</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>2236412</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle grinder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT749521-1500</td>
			<td>Not required if using bead mill homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BW17-516F</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td></td>
			<td>Needed if using a fly pad for CO2 delivery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512</td>
			<td>Alternate magnetic stir bars can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Example box used for feeding assays shown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Alternate heating device may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td>
			<td>American Home &#38; Habit Inc.</td>
			<td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td>
			<td>Alternate options can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

특정 모기 종의 암컷은 달걀 발달에 필요한 단백질이 풍부한 혈액 식사를 얻기 위해 척추 동물 호스트를 물면서 질병을 퍼뜨릴 수 있습니다. 실험실에서, 연구원은 식사 구성의 조작을 허용하는 막 피더를 통해 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공할 수 있습니다. 여기서는 Aedes aegypti 모기에 혈액과 인공 혈액 식사를 공급하고 개별 여성이 소비하는 양을 정량화하는 방법을 제시합니다.
인공/혈액 식사의 표적 공급 및 정량화는 모기 행동과 생리학에 대한 식사 구성 요소의 효과를 테스트하고, 주입없이 약리화합물을 제공하고, 특정 병원균으로 모기를 감염시키는 등 광범위한 용도를 가지고 있습니다. 먹이주기 전에 식사에 형광염염료를 첨가하면 후속 식사 크기 정량화를 할 수 있습니다. 모기에 의해 소모된 식사 부피는 여성이 행동 실험을 위해 나중에 이용되어야 하는 경우에, 또는 96웰 플레이트에 있는 개별 적인 여성을 균질화하고 종점 분석으로 플레이트 판독기를 사용하여 형광 수준을 측정하여 무게로 측정될 수 있습니다. 식사 크기 정량화는 식사 구성 요소를 변경하는 것이 섭취된 식사 량을 변경하는지 또는 식사 소비가 모기 균주 마다 다른지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 정확한 식사 크기 정량화는 호스트 매력이나 대변에 미치는 영향을 측정하는 것과 같은 다운스트림 분석을 위해서도 중요합니다. 여기에 제시된 방법은 며칠 동안 식사 소화를 추적하거나 단일 모기에 의한 각 식사의 소비를 정량화하기 위해 다른 식사 (꿀 및 혈액 과 같은)에 추가 된 여러 구별 마커를 포함하도록 더 적응 할 수 있습니다.
이 방법을 통해 연구자들은 수백 개의 개별 모기가 소비하는 식사 량을 비교하기 위해 높은 처리량 측정을 단독으로 수행할 수 있습니다. 따라서 이러한 도구는 다양한 생물학적 질문에 대답하기 위한 모기 연구자 커뮤니티에 광범위하게 유용할 것입니다.

도 1은 글리튜브조립을 위한 회로도를 제시하는 반면, 도 2는 여기에 설명된 형광계 분석기를 이용하여 식사 크기를 측정하는 실험설계에 대한 개요를 나타낸다. 도 3은 혈액 공급 실험에서 대표적인 형광식 식사 크기 측정을 제공한다. 도 4, 도 5및 도 6은 이 프로토콜을 사용하여 해결할 수 있는 생물학적 질문의 샘플링을 도시한다. 프로토콜의 응용 프로그램은 광범위하고 혈액 식사 구성변경, 약리학적 화합물 을 공급, 정확하게 최적 이하의 혈액 식사 또는 작은 꿀 식사를 정량화하고, 모기 유전자형에 걸쳐 먹이 행동을 비교 포함.
식사 량 계산에 대한 표준 곡선을 생성하기 위해, 형광 수치는 각각 0.002 % 형광액을 함유한 지정된 기준 우물과 알려진 식사 부피를 포함하는 지정된 기준 우물에서 플롯됩니다(그림3A). 남은 우물에서 의형 수치는, 미공급 모기의 부정적인 대조군 또는 식사를 제안한 모기의 실험단으로부터 모기를 포함하는, 각 모기에 의해 소비되는 식사 량(μL)을 정량화하기 위하여 이 표준 곡선과 비교된다(그림 3B). 이 분석에서 기준선 판독값을 검증하려면, 미혼 음성 대조군에서 모기가 소비된 μL의 양수 값을 할당하지 않는 것을 확인되어야한다(도 3B, 왼쪽). 실험군의 모든 암컷이 혈액식을 제공받았지만, 일부 모기는 먹이지않았다(도 3B, 중간)일부는 하지 않았다(그림3B, 오른쪽). 이 결과는 이 프로토콜에서 두 가지 유형의 데이터를 얻을 수 있음을 보여줍니다: 1) 주어진 식사에 공급하는 총 여성의 비율, 2) 주어진 식사에 먹이 는 여성에 의해 섭취 볼륨.
이 프로토콜은 다양한 단백질 조성물로 식사를 제공하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 4A, B는 형광이 첨가된 식사를 사용하여 수집된 데이터를 표시합니다. 먹이는 모기의 비율과 섭취한 식사 량은 각각 형광 수치에서 계산되었습니다. 이 수치는 매우 민감하고 μL의 정확한 정량화를 허용하지만, 모기가 미래의 라이브 실험에 사용할 수 없다는 한계가 있습니다. 그림 4C,D는 형광없이 식사를 제공 한 후 눈에 먹이 또는 공급으로 득점 된 모기와 독립적 인 실험에서 수집 된 데이터를 보여줍니다. 식사 크기는 5 모기의 그룹에서 평균 체중 / 여성으로 계산되었다. 이러한 중량 측정은 형광 측정보다 덜 민감하지만, 암컷을 회수하고 더 라이브 실험을 위해 사용될 수 있습니다. 사료를 먹는 모기의 비율은 그림 4A 및 도 4C에반영된 것과 같이 다른 실험일에 따라 다를 수 있습니다.
그림 5는 모기 호스트 추구 행동을 통제하는 약을 포함하는 식사의 양을 보여줍니다. 이러한 실험에서, 암컷은 인간 NPY Y2 수용체 작용제, TM30338의 100 μM을 가진 혈액, 식염수 + ATP 식사, 식염수 + ATP 식사를 제공하였다. 이 약은 Ae. aegypti NPY 같이 수용체 7의 활성화를 통해 호스트 를 찾는 행동을 변경합니다. 식사 크기를 측정하는 것은 연구원이 각 여성에 의해 소비된 복용량을 계산하는 것을 허용하기 때문에 포스트 혈액 공급 행동에 이 약의 효력을 평가하기 위하여 실험의 해석을 위해 중요합니다.
이전 예에서, 여성은 혈액 또는 대체 혈액 식사를 공급했다, 모두는 3-5 μL 식사 결과(그림 3, 도 4, 도 5). 이 형광 기반 분석은 또한 평균 그룹 체중 측정에서 정확하게 분별할 수 없는 더 작은 및/또는 더 많은 가변 식사 크기를 측정하는 데 사용될 수 있습니다. 도 6에서,동일한 형광 정량화 프로토콜은 0.002% 형광을 함유한 10%의 자당으로 포화된 면공에 대한 글리튜브를 교환하여 넥타 공급 거동을 측정하는 데 사용되었다. 여성스타일로 넥타 설탕의 존재를 감지할 수 없고27의수유를 시작하지 않기 때문에 넥타 설탕은 글리튜브 분석에서 제시될 수 없다. 이 데이터는 연구원이 설탕 식사가 이전 작업34 (그림 6)와합의하여 혈액 식사보다 일관되게 작다는 것을 결정할 수 있게 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> 그림 1: 모기에게 식사를 공급하는 데 사용되는 글리튜브 방법의 설정. (A)모기에게 혈액 과 다른 식사를 공급하는 데 사용되는 해체 된 글리튜브의 회로도. (B)글리튜브의 회로도는 메쉬 뚜껑이 있는 모기 의 용기 위에 제시하였다. 암컷 모기는 메쉬 뚜껑을 관통하여 먹이를 줄 수 있습니다. (C)글리튜브(위) 및 여성 Aedes aegypti 모기의 사진은 글리튜브가 배달한 식사에서 전, 도중, 그리고 먹이를 주고(아래, 왼쪽에서 오른쪽으로) 모기는 멤브레인 피더에 액세스하기 위해 용기를 덮고 있는 메쉬를 관통하는 것으로 나타났습니다. (D)여성 Ae. aegypti 모기의 출현을 보여주는 사진 (왼쪽) 인공 혈액 식사 (오른쪽, 위) 또는 식염수 + ATP 식사 (오른쪽, 아래)에 유혹한. 글리튜브 방법은 이전에 코스타 다 실바 외에 게시되었습니다. (2013)20. 사진 제공(C)및(D)알렉스 와일드의 호의입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> 그림 2: 글리튜브 혈액 공급 프로토콜 후 식사 크기를 정량화하는 방법의 회로도. (A)모기는 형광체(상단, 실험군)가 있거나 식사 가 없는 식사(바닥, 미혼 음성 대조군)로 식사를 제공합니다. (B)개별 모기는 수유 실험을 종료한 후 96웰 플레이트에 첨가된다. (C)표준 곡선은 0.002% 형광을 함유한 고액의 식사량을 사용하여 생성됩니다. (D)모기는 모든 소비형형광을 방출하기 위해 균질화되고, 각 우물의 형광 수준은 플레이트 판독기를 사용하여 정량화된다. 이러한 형광 정량화 방법은 Liesch 외에서 수정됩니다. (2013)34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> 그림 3: 형광계 정량화를 위한 글리튜브 혈액 공급 실험. (A)미공급 대조군으로부터 모기가 0.002% 형광실(y축 스케일 = 임의 단위)을 함유한 식사의 공지된 수량에 첨가된 우물에서 얻은 표준 곡선 측정. (B)미지급 대조군(왼쪽, 검은색, n=40), 혈액에 공급된 실험군(중간, 빨강, n=37) 및 혈액(오른쪽, 빨강, n=23)에 공급되지 않은 실험군에서 여성에 대한 형광 측정값을 사용하여 계산된 식사 부피. 각 점은 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위가 있는 중앙값으로 표시됩니다. 편지는 통계적으로 구별되는 그룹, 던의 다중 비교와 크루스칼- 월리스 테스트, p&0.01을 나타냅니다. 이러한 데이터는 Jové 외(2020)27에게시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> 그림 4: 단백질 구성이 다른 식사의 정량화. 암컷은 양혈액(적색), 인간의 혈액 단백질(Kogan (1990)22)(오렌지), 또는 단백질이 없는 식염수 + ATP 식사(아쿠아)7의식사를 제공하였다. (A)형광 수치를 사용하여 득점한 여성의 비율. 각 포인트는 12-16 여성의 그룹을 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 12의 중앙값으로 표시됩니다. (B)형광 수치를 사용하여 계산된 식사 량. 각 점은 그림 4A에서단일 시험에서 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 12의 중앙값으로 표시됩니다. (C)인공막 수유 후 완전히 채광된 암컷의 백분율이 눈으로 채점하였다. 각 점은 20-30 명의 여성 그룹에서 유혹 된 여성의 퍼센트를 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 23의 중앙값으로 표시됩니다. (D)수유 후 체중/여성으로 득점된 식사 사이즈는 눈으로 채점하였다. 무게는 5 모기의 단의 평균으로 계산되었습니다. 데이터는 범위, n = 23의 중앙값으로 표시됩니다. A–D: 편지는 통계적으로 구별 그룹을 나타냅니다, 던의 여러 비교와 크루스칼 - 월리스 테스트, p&0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> 그림 5: 약리학적 화합물이 있는 식사의 정량화. 여성은 양 혈액 (빨강), 식염수 + ATP (아쿠아), 식염수 + ATP + 인간 NPY Y2 수용체 작용제 TM30338 (다크 블루)의 100 μM 용량의 식사를 소비합니다. 형광 수치를 사용하여 계산된 식사 량. 각 점은 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위, n = 12의 중앙값으로 표시됩니다. 편지는 통계적으로 구별되는 그룹, 던의 다중 비교와 크루스칼- 월리스 테스트, p&0.05를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> 그림 6: 작은 꿀 식사의 정량화. (A)꿀 먹이 분석의 회로도. (B)야생형 암컷에 대한 형광 측정값을 사용하여 계산된 식사 부피는 물(파란색, n=36) 또는 10% 자당(녹색, n =53)의 식사를 제공하며, 각각 0.002% 형광액을 가진 넥타 수유 분석서이다. 각 점은 개별 여성의 측정값을 나타냅니다. 데이터는 범위가 있는 중앙값으로 표시됩니다. 편지는 통계적으로 구별되는 그룹, Mann-Whitney 시험, p&05를 나타냅니다. 이러한 데이터는 Jové 외(2020)27에게시되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">인공 혈액 식사</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>주식 용액의 농도 (mg / mL)</td>
			<td>식사 중 재고 용액량 (μL/mL)</td>
			<td>최종 식사 농도 (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">단백질 성분*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ 글로불린</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤모글로빈</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>알부민</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 단백질</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">비 단백질 성분</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>주식 용액의 농도 (mM)</td>
			<td>식사 중 재고 용액량 (μL/mL)</td>
			<td>최종 식사 농도 (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>γ 글로불린 재고</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>나에코3
</td>
			<td>γ 글로불린 재고</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*단백질 성분은 400mM NaHCO3에 용해되고 가변량인 NaCl(2-4%)을 포함하는 γ-글로불린을 제외한 이중 증류수의 재고 용액으로 제조됩니다. 상품에.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 인공 혈액 식사 준비 를 위한 레시피 (코간 (1990)22에서적응). 인공 혈액은 인간의 혈액에서 정기적으로 발견되는 단백질과 비 단백질 성분으로 구성되며 이러한 구성 요소의 비율을 변경할 수있는 옵션을 제공합니다. 모기는 인공 혈액7,22에먹이 후 계란을 생산할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">식염수</td>
		</tr>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>주식 용액의 농도 (mM)</td>
			<td>식사 중 재고 용액량 (μL/mL)</td>
			<td>최종 식사 농도 (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>나에코3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>물</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: ATP와 식염수 식사 레시피 (듀발 등에서 적응) (2019)7). 단백질이 없는 식염수 식사는 여전히 혈액 공급 후 발생하는 복부 팽창을 모방하면서 모기에 관심있는 화합물을 전달하는 데 사용할 수 있지만 단백질을 섭취 할 때 발생하는 계란 발달을 유발하지 는 않습니다.

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

이 프로토콜의 목표는 인공 막 피더를 통해 Aedes aegypti 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공하고 섭취한 식사의 양을 정확하게 정량화하는 것입니다.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.6K 조회수.  The Rockefeller University. 이 프로토콜의 목표는 인공 막 피더를 통해 Aedes aegypti 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공하고 섭취한 식사의 양을 정확하게 정량화하는 것입니다.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

마우스 복막 구멍 세포의 분리

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

형광 활성 세포 정렬 (외과)에 의해 특정 세포 인구의 정제

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting chromosomal rearrangements, and studying three-dimensional (3D) organization of chromosomes in the cell nucleus. The advent of laser capture microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) allows obtaining large quantities of DNA from single cells. The increased sensitivity of WGA kits prompted us to develop chromosome paints and to use them for exploring chromosome organization and evolution in non-model organisms. Here, we present a simple method for isolating and amplifying the euchromatic segments of single polytene chromosome arms from ovarian nurse cells of the African malaria mosquito Anopheles gambiae. This procedure provides an efficient platform for obtaining chromosome paints, while reducing the overall risk of introducing foreign DNA to the sample. The use of WGA allows for several rounds of re-amplification, resulting in high quantities of DNA that can be utilized for multiple experiments, including 2D and 3D FISH. We demonstrated that the developed chromosome paints can be successfully used to establish the correspondence between euchromatic portions of polytene and mitotic chromosome arms in An. gambiae. Overall, the union of LCM and single-chromosome WGA provides an efficient tool for creating significant amounts of target DNA for future cytogenetic and genomic studies.

Chromosome painting is a useful method for studying organization of the cell nucleus and evolution of the karyotype. Here, we demonstrate an approach to isolate and amplify specific regions of interest from single polytene chromosomes that are subsequently used for two- and three-dimensional fluorescent in situ hybridization (FISH).

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...