Accumulation and distribution of fluorescent microplastics in the early life stages of zebrafish. Introducción. La bioacumulación de los microplásticos juega un papel clave en sus efectos tóxicos. Sin embargo, como partículas, sus bioacumulaciones son diferentes de muchos otros contaminantes.
Aquí se describe un método factible para determinar visualmente la acumulación y distribución de microplásticos en embriones o larvas de pez cebra utilizando microplásticos fluorescentes. Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la guía nacional De animales de laboratorio para la revisión ética del bienestar animal. Uno, la recolección de embriones.
Los peces cebra adultos se originan en el Centro de Recursos de Pez Cebra de China. Los peces se mantienen en tanques de vidrio de 20 litros con sistema de agua del grifo filtrada por carbón recirculante a una temperatura constante, es decir, 28 grados Celsius, en un fotoperiodo de 14 y 10 horas, luz: oscuridad. Los peces son alimentados dos veces al día con Nauplios Artemia.
Se recomienda que el alimento se dé a un máximo del 3% de peso de pescado por día, y debe comerse dentro de los cinco minutos cada vez. Los peces cebra adultos bien desarrollados se transfieren al tanque de desove en una proporción de un macho a dos hembras la noche antes de la cría. A la mañana siguiente, los peces comienzan a desovar después del inicio del ciclo de luz.
Los huevos se recogen usando una pipeta Pasteur, se enjuaguen con la solución de Hank al 10% varias veces y luego se comprueba la fertilización con un microscopio. Los huevos fertilizados experimentan el período de escisión después de aproximadamente dos horas después de la fertilización y se pueden identificar claramente. Los embriones fertilizados se incuban en un casto de 500 mililitros que contiene 200 mililitros de solución de Hank al 10% con azul de metileno al 1% para su desinfección a 28 grados celsius.
La velocidad de carga no es superior a un embrión en cada solución de 2 mililitros. Dos, preparación de suspensiones microplásticas. La solución común de perlas de poliestireno verdes con etiqueta fluorescente con un diámetro nominal de 500 nanómetros se sonica durante 10 minutos.
Diluya la solución común con la solución de Hank al 10% para producir las soluciones de exposición deseadas, a saber, 0.1, 1 y 10 miligramos por litro. Las soluciones de exposición de los microplásticos siempre están recién preparadas antes de la exposición. Tres, la exposición a microplásticos.
Seis embriones recién fertilizados son seleccionados al azar, y luego transferidos a cada pozo de seis placas de pozo que contienen cinco mililitros de soluciones microplásticas con diferentes concentraciones. Se incluyen los grupos de control que contienen la solución de 10% Hank. Para cada tratamiento se utilizan pozos triplicados, con un total de 18 embriones.
Los embriones se incuban bajo el mismo ciclo claro-oscuro y temperatura que los adultos, y se observan cada 12 horas. Los muertos son retirados inmediatamente. Las soluciones de microplásticos se renuevan en un 90% cada 24 horas.
Durante el período de exposición, los peces no son alimentados. Generalmente, la eclosión del embrión comienza a las 48 horas después de la fertilización y se completa aproximadamente a las 72 horas después de la fertilización. Cuatro, evaluación de la distribución de microplásticos.
A las 24-48-72-96-y 120 horas después de la fertilización, los embriones y larvas, uno de cada una de las tres réplicas, se seleccionan al azar y se enjuagan con la solución de Hank al 10%. Los embriones y las larvas están dispuestos y preparados para la observación. De antemano, las larvas se transfieren a una placa de Petri y se exponen a 0,016% tricaína para la anestesia.
Los peces se observan con microscopio de fluorescencia y se les toma una imagen con software de imágenes. La intensidad de fluorescencia en peces se cuantifica aún más con ImageJ NIH. Resultados representativos.
Se muestra en los resultados que los microplásticos pueden bioacumularse en embriones y larvas de pez cebra de una manera dependiente de la concentración. Antes de la eclosión, se encuentra una fuerte fluorescencia alrededor del corion embrionario; mientras que en las larvas de peces cebra, el saco vitelino, el pericardio y el tracto gastrointestinal son los principales sitios acumulados de microplásticos. discusión. Este resultado avanzará nuestra comprensión sobre la toxicidad de los microplásticos para los peces, y el método descrito aquí puede potencialmente generalizarse para determinar la acumulación y distribución de otros tipos de materiales fluorescentes en las primeras etapas de la vida del pez cebra.
Dado que el corion actuará como una barrera efectiva contra las partículas de gran tamaño, el proceso de decorionación antes de la exposición puede ser necesario. Sin embargo, el embrión con el corion intacto es más recomendable para evaluar la ecotoxicidad de los contaminantes al considerar la condición de exposición en el mundo real. El comportamiento de los microplásticos en la solución también es crítico para la biodisponibilidad.
Las características fisicoquímicas de los microplásticos deben rastrearse a lo largo de la duración de la exposición.
