El objetivo general de este procedimiento es seguir en tiempo real la formación de proplatelet a partir de megacariocitos de ratón, que maduraron en su entorno nativo. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido. Se pueden analizar muchos megacariocitos y visualizar la formación de proplatlets en solo seis horas, en lugar de esperar el primer día de cultivo como para los megacariocitos de ratón in vitro.
Una aplicación interesante de este método es la posibilidad de estudiar el efecto del tratamiento farmacéutico o la mutación genética, específicamente en el paso de extensión proplatelet. Aquí no hay interferencias con el proceso de diferenciación, como en el caso del cultivo in vitro. Este video ayuda a garantizar estos pasos clave para enjuagar y cortar la médula ósea.
También se explica cómo clasificar la morfología y los megacariocitos, lo que es realmente útil para la caracterización de defectos en la enfermedad trombofílica. Para comenzar, caliente el amortiguador de Tyrode a 37 grados centígrados y encienda la cámara de calentamiento del microscopio para llevar la temperatura a 37 grados centígrados. Prepare todas las herramientas necesarias, como un temporizador, cámaras de incubación, jeringas calibre 21 de cinco mililitros, fórceps, una cuchilla de afeitar, pipetas Pasteur, portaobjetos de vidrio y tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Enjuague la médula ósea con dos mililitros del tampón de Tyrode introduciendo una aguja de calibre 21 en la abertura del fémur en el lado de la rodilla, y presione lentamente el émbolo para recuperar un cilindro de médula intacto. Use una pipeta de plástico de tres minutos para transferir cuidadosa y suavemente la médula ósea intacta a un portaobjetos de vidrio. Cortar los extremos de la médula que pueden haber sido comprimidos en el momento del lavado.
Luego corte secciones transversales delgadas de 0,5 milímetros de espesor con una cuchilla de afeitar afilada para evitar dañar los megacariocitos. Usando una pipeta de plástico, recoja 10 secciones en un tubo de un mililitro que contenga el tampón de Tyrode. Transfiera cuidadosamente las secciones a una cámara de incubación con un diámetro de 13 milímetros.
Aspire el tampón y ajuste el volumen a 30 microlitros del tampón de Tyrode complementado con suero de 5% de ratón. Coloque las secciones a distancia. Selle la cámara autoadhesiva con un deslizamiento de cubierta de 22 por 55 milímetros, inclinando el deslizamiento de la cubierta para evitar la formación de burbujas de aire.
Coloque la cámara en la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados. Inicie el cronómetro y ejecute el experimento durante seis horas a 37 grados centígrados, haga videos para grabar la transformación de los megacariocitos. Después de 30 minutos, las células de la médula migran gradualmente a la periferia del explante formando una capa mono.
Después de una hora de incubación, los megacariocitos se pueden identificar por su gran tamaño y núcleos polilobulados. El número de megacariocitos aumenta después de tres horas de incubación, y algunos tienen largas extensiones. Dibuja un mapa para localizar cada sección en la cámara de incubación.
Después de una hora, identifique los megacariocitos visibles, que son células polilobuladas gigantes en la periferia de cada sección, y trace sus posiciones en el dibujo. Repita este procedimiento después de tres y seis horas. Los megacariocitos se cuentan manualmente y se clasifican según su morfología a las tres y seis horas después del sellado de la cámara de incubación.
Se clasifican como pequeños, grandes con intención gruesa y proplatelet que se extienden. Con la ayuda del mapeo, su evolución se puede seguir a lo largo del tiempo. Los resultados se expresan como un porcentaje de cada clase en cada momento de observación.
Clásicamente, la mitad de los megacariocitos visibles en la periferia extienden los proplatlets a las seis horas para la médula ósea de ratón de tipo salvaje. El destino de los megacariocitos redondos fue seguido por la captura de imágenes secuenciales a lo largo del tiempo para obtener imágenes de cómo forman los proplatlets. Una cosa importante a recordar al intentar este procedimiento es mantener los explantes a 37 grados Centígrados durante la duración del experimento.
Una temperatura diferente puede cambiar los resultados. Curiosamente, el protocolo de explante se puede utilizar después de experimentos de microscopía introvertidos. Al final, los megacariocitos en los explantes de médula ósea serán naturalmente fluorescentes, y su comportamiento se puede investigar fácilmente.
Esto permite combinar diferentes tratamientos en los mismos animales y así reducir el número de ratones. En conclusión, el método de explante es rápido, simple y proporciona mucha información sobre la capacidad de los megacariocitos naturales a los proplatlets externos. El hallazgo cualitativo y cuantitativo resultante es clave para nuestra comprensión de la enfermedad trombofílica.
en un contexto fisiológico o patológico.
