Este protocolo se puede utilizar para agilizar el aislamiento y la identificación de los nematodos Caenorhabditis de la naturaleza y registrar datos ecológicos y ambientales importantes asociados con el entorno natural de los nematodos. Las principales ventajas de esta técnica son su escalabilidad y precisión, que son posibles gracias al aprovechar las plataformas de recopilación de datos móviles, las bases de datos basadas en la nube y las funciones estandarizadas de procesamiento de datos. Para comenzar, identifique una ubicación para inspeccionar los nematodos Caenorhabditis.
Para crear un proyecto Fulcrum, cree una cuenta con Fulcrum en línea utilizando un acuerdo educativo sin costo y agregue la aplicación de muestreo de campo de nematodos. A continuación, agregue la aplicación de aislamiento de nematodos. Imprima un conjunto de etiquetas de código QR como etiquetas C para rastrear las colecciones y etiquetas S para rastrear los aislamientos de nematodos.
Coloque las etiquetas C en las bolsas de plástico Ziploc para empacar. Mantenga el conjunto de etiquetas S para su uso en el laboratorio. Seleccione el muestreo de campo de nematodos en el menú desplegable de la aplicación móvil Fulcrum y presione más para iniciar un nuevo registro en el proyecto.
Tome una foto del sustrato. Toque el campo C-Label y elija escanear. Escanee el código de barras en la bolsa de recolección con la cámara del dispositivo móvil y, a continuación, toque Listo.
Toque el campo de sustrato y seleccione un tipo de sustrato. Mida la temperatura superficial del sustrato utilizando el termómetro sin contacto y registre el valor en el campo de temperatura del sustrato. También mida y registre la temperatura ambiente y la humedad.
Guarde y grabe en Fulcrum tocando guardar en la parte superior izquierda de la pantalla. Recoge una cucharada del sustrato sin palos u otras piezas duras invirtiendo la bolsa de recogida como guante para recoger el sustrato, luego sella la bolsa. Para cada bolsa Ziploc, anote la etiqueta C en la bolsa y coloque una etiqueta C a juego en la tapa de una placa de 10 centímetros manchada con bacterias OP50.
Transfiera una cucharada de muestra de cada bolsa de recolección a las placas C con una cuchara de plástico limpia. En la aplicación Fulcrum, elija aislamiento de nematodos en el menú de la aplicación. A continuación, cree un nuevo registro de aislamiento tocando el icono más en la parte inferior derecha.
Toque el botón de selección para encontrar la etiqueta C asociada con una muestra. Toque el icono de búsqueda. Luego toque el ícono de escaneo para escanear el código QR de C-Label.
Busque nematodos en la placa C con un microscopio de disección. Toque los gusanos en el campo de muestra para registrar la presencia de nematodos en la muestra. Si no hay nematodos presentes, parafilme la placa C y deséchela en un contenedor de riesgo biológico.
Si hay nematodos presentes, aísle hasta cinco nematodos de la placa C y transfiera cada uno a su propia placa S. A continuación, toque el campo placas con etiqueta S para ingresar la placa S utilizada para este aislamiento. Toca el más en la parte inferior derecha.
Toque S-Label y luego haga clic en escanear para abrir la cámara del dispositivo, luego escanee el código QR S-Label en la placa S. Toque el botón de guardar en la parte superior derecha una vez que el registro de aislamiento tenga toda la información agregada correctamente, luego parafilme las placas S con nematodos aislados y déjelos a un lado en un área designada para sostener placas S con nematodos. Inicie sesión en el sitio web de Fulcrum y seleccione la aplicación de aislamiento de nematodos.
Haga clic en exportador para descargar un archivo zip que contiene el aislamiento de nematodos s_labeled_plates. archivo csv. Navega a la plantilla de genotipado aislado salvaje de Google Sheet y copia la hoja de cálculo de Google.
Coloque las etiquetas S copiadas del aislamiento de nematodos s_labeled_plates. csv en la hoja de genotipado. Compruebe si hay animales que proliferan en las placas S 48 horas después del aislamiento.
Si una placa S tiene animales en proliferación, ingrese uno en la columna de proliferación 48 en la hoja de genotipado, luego mueva la placa S a una caja etiquetada como caja de proliferación de 48 horas uno. Verifique las placas S que no proliferaron a las 48 horas posteriores al aislamiento nuevamente a las 168 horas posteriores al aislamiento. Si una placa S está proliferando ahora, ingrese una en la columna de proliferación 168 en la hoja de genotipado y luego mueva la placa S a una caja etiquetada como caja de proliferación de 168 horas uno.
Filtra el genotipo en Hoja de cálculo de Google para incluir solo las etiquetas S en un cuadro de proliferación que se va a lisar y, a continuación, selecciona las columnas etiqueta S a través de los nodos de lisis. Imprima una hoja de cálculo de lisis para cada caja de proliferación que se va a lisar. Prepare 12 tubos de tira de pozo para que las muestras se lisen.
Destapar un tubo de tira y añadir ocho microlitros de tampón de lisis a cada tapón con un pipete de repetición. Elija de tres a cinco animales de las placas de origen en las posiciones de la tapa indicadas en la hoja de trabajo de lisis. Repita hasta ocho tubos de tira y coloque los tubos de tira en el congelador de menos 80 grados centígrados.
Retire los juegos de tubos de tira y ejecute el programa de lisis en el termociclador. Luego guarde los lisados a menos 80 grados centígrados durante un máximo de una semana. Retire los tubos de la tira del congelador de menos 80 grados centígrados y descongele el material de lisis en hielo.
Mientras el material de lisis se descongela, prepare mezclas maestras ITS2 y SSU en tubos separados sobre hielo. Agregue dos microlitros de lisado al pozo apropiado en la placa de PCR con una pipeta multicanal de bajo volumen. Ejecute las PCR con el programa de termociclador apropiado y registre qué S-Labels producen productos ITS2 o SSU PCR en la hoja de genotipado.
Para cada muestra que sea ITS2 positiva, utilice el producto ITS2 PCR restante para la secuenciación de Sanger y obtenga los archivos de salida seq para cada S-Label de la plataforma de secuenciación. Navegue hasta el sitio web de NBCI BLAST en un navegador web para comenzar la búsqueda de BLAST. Para las secuencias de placa S que BLAST a una especie de Caenorhabditis, ingrese el género completo y el nombre de la especie del golpe BLAST superior en la columna de identificación de especies.
Asigne un nombre a las cepas con nombres únicos, siguiendo las convenciones de nomenclatura de Caenorhabditis e introduzca los nombres de las cepas en la columna de nombre de cepa. Para procesar los datos, navegue hasta el sitio web de Fulcrum y exporte los datos sin procesar del proyecto desde la base de datos de Fulcrum. Abra un nuevo script de R y siga las instrucciones de la viñeta easyfulcrum para procesar los datos de recopilación.
En NBCI BLAST, los resultados de S-Label S-05554 muestran que el mayor éxito es Caenorhabditis briggsae. Además, algunos nematodos aislados requieren un esfuerzo adicional para genotipar. Por ejemplo, aproximadamente el 2% de los aislados no se amplifican con el conjunto de cebadores de PCR SSU después del primer intento de lisis y se debe confiar en que el material de lisis es adecuado para la amplificación con el conjunto de imprimación ITS2.
Después de este procedimiento, los investigadores pueden explorar los datos ecológicos y ambientales asociados con los aislados de nematodos silvestres para identificar ubicaciones y características de sustrato que tienen más probabilidades de albergar especies específicas de nematodos.
