이 프로토콜은 자연에서 Caenorhabditis 선충류의 분리 및 식별을 간소화하고 선충류의 자연 환경과 관련된 중요한 생태 및 환경 데이터를 기록하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 모바일 데이터 수집 플랫폼, 클라우드 기반 데이터베이스 및 표준화 된 데이터 처리 기능을 활용하여 가능하게하는 확장 성 및 정확성입니다. 시작하려면 Caenorhabditis 선충류를 조사 할 위치를 확인하십시오.
Fulcrum 프로젝트를 만들려면 무료 교육 계약을 사용하여 Fulcrum 온라인 계정을 만들고 선충류 필드 샘플링 응용 프로그램을 추가하십시오. 그런 다음 선충류 격리 응용 프로그램을 추가하십시오. QR 코드 라벨 세트를 C-라벨로 인쇄하여 컬렉션을 추적하고 S-라벨을 추적하여 선충류 격리를 추적하십시오.
포장을 위해 C-라벨을 Ziploc 비닐 봉지에 부착하십시오. 실험실에서 사용할 수 있도록 S-라벨 세트를 보관하십시오. Fulcrum 모바일 앱의 드롭다운 메뉴에서 선충류 필드 샘플링을 선택하고 더하기 키를 눌러 프로젝트에서 새 레코드를 시작합니다.
기판의 사진을 찍으십시오. C-레이블 필드를 탭하고 스캔을 선택합니다. 모바일 장치 카메라를 사용하여 수집 가방의 바코드를 스캔한 다음 완료를 탭합니다.
기판 필드를 탭하고 기판 유형을 선택합니다. 비접촉 온도계를 사용하여 기판의 표면 온도를 측정하고 기판 온도 필드에 값을 기록하십시오. 또한 주변 온도와 습도를 측정하고 기록하십시오.
화면 왼쪽 상단의 저장을 탭하여 Fulcrum에 저장하고 기록하십시오. 수집 가방을 장갑으로 뒤집어 스틱이나 다른 단단한 조각이없는 기질의 큰 스푼을 모아 기판을 집어 들고 가방을 밀봉하십시오. 각 Ziploc 가방에 대해 가방의 C 라벨을 기록하고 OP50 박테리아가 발견 된 10 센티미터 플레이트의 뚜껑에 일치하는 C 라벨을 부착하십시오.
깨끗한 플라스틱 숟가락을 사용하여 각 수집 백에서 C 플레이트로 샘플 한 스푼을 옮깁니다. Fulcrum 응용 프로그램의 응용 프로그램 메뉴에서 선충류 격리를 선택하십시오. 그런 다음 오른쪽 하단의 더하기 아이콘을 탭하여 새 격리 레코드를 만듭니다.
선택 버튼을 탭하여 샘플과 연결된 C-Label을 찾습니다. 검색 아이콘을 누릅니다. 그런 다음 스캔 아이콘을 탭하여 C 라벨 QR 코드를 스캔하십시오.
해부 현미경으로 C 플레이트에서 선충류를 찾으십시오. 샘플 필드의 웜을 탭하여 샘플에 선충류가 있음을 기록하십시오. 선충류가 없으면 C 플레이트를 파라 필름으로 만들고 생물학적 위험 쓰레기통에 버리십시오.
선충류가있는 경우 C 플레이트에서 최대 다섯 개의 선충류를 분리하고 각각을 자체 S 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 S 라벨이 붙은 플레이트 필드를 탭하여이 분리에 사용 된 S 플레이트로 들어갑니다. 오른쪽 하단의 더하기를 누릅니다.
S-Label을 탭한 다음 스캔을 클릭하여 장치 카메라를 연 다음 S-플레이트에서 S-Label QR 코드를 스캔합니다. 격리 기록에 모든 정보가 올바르게 추가되면 오른쪽 상단의 저장 버튼을 탭한 다음 격리 된 선충류로 S 플레이트를 파라 필름 한 다음 선충류가있는 S 플레이트를 고정하도록 지정된 영역에 따로 두십시오. Fulcrum 웹 사이트에 로그인하고 선충류 격리 응용 프로그램을 선택하십시오.
내보내기를 클릭하여 선충류 격리 s_labeled_plates가 포함 된 zip 파일을 다운로드하십시오. csv 파일. 야생 격리 지노타이핑 템플릿 Google 시트로 이동하여 Google 스프레드시트를 복사합니다.
선충류 격리 s_labeled_plates에서 복사 한 S- 라벨을 놓습니다. csv 열을 지노타이핑 시트에 넣습니다. 격리 후 48 시간 후에 S-플레이트에서 증식하는 동물을 확인하십시오.
S-플레이트에 증식하는 동물이 있는 경우, 유전자형 분석 시트의 증식 48 컬럼에 하나를 입력한 다음, S-플레이트를 48시간 증식 박스라고 표시된 박스로 옮긴다. 격리 후 48시간에 증식하지 않았던 S-플레이트를 격리 후 168시간에 다시 확인한다. S-플레이트가 현재 증식하고 있다면, 지노타이핑 시트의 증식(168) 컬럼에 하나를 입력한 다음, S-플레이트를 168시간 증식 박스로 라벨링된 박스로 옮긴다.
Google 시트에서 유전자형을 필터링하여 용해할 하나의 증식 상자에 S-레이블만 포함시킨 다음 용해 노드를 통해 S-레이블 열을 선택합니다. 용해될 각 증식 상자에 대한 용해 워크시트를 인쇄하십시오. 용해 될 샘플에 대해 12 웰 스트립 튜브를 준비하십시오.
하나의 스트립 튜브를 풀고 반복 파이프터로 각 캡에 여덟 마이크로 리터의 용해 버퍼를 추가하십시오. 소스 플레이트에서 세 마리에서 다섯 마리의 동물을 용해 워크 시트에 표시된 캡 위치로 선택하십시오. 최대 여덟 개의 스트립 튜브에 대해 반복하고 스트립 튜브를 영하 80도 냉동실에 놓습니다.
스트립 튜브 세트를 제거하고 열순환기에서 용해 프로그램을 실행하십시오. 그런 다음 용해물을 섭씨 영하 80도에서 최대 일주일 동안 보관하십시오. 영하 80도 냉동고에서 스트립 튜브를 제거하고 얼음 위에서 용해 물질을 해동하십시오.
용해 물질이 해동되는 동안 ITS2 및 SSU 마스터 믹스를 얼음 위의 별도의 튜브에 준비하십시오. 두 마이크로리터의 용해물을 저용량 다중 채널 피펫으로 PCR 플레이트의 적절한 웰에 첨가한다. 적절한 열순환 프로그램으로 PCR을 실행하고 지노타이핑 시트에 ITS2 또는 SSU PCR 제품을 생산하는 S-라벨을 기록하십시오.
ITS2 양성인 각 샘플에 대해 나머지 ITS2 PCR 산물을 사용하여 생어 시퀀싱을 수행하고 시퀀싱 플랫폼에서 각 S-Label에 대한 seq 출력 파일을 가져옵니다. 웹 브라우저에서 NBCI BLAST 웹 사이트로 이동하여 BLAST 검색을 시작합니다. Caenorhabditis 종에 대한 BLAST가 있는 S-플레이트 서열의 경우, 종 ID 컬럼에 히트된 상위 BLAST의 전체 속 및 종 이름을 입력하십시오.
Caenorhabditis 명명법 규칙에 따라 고유한 이름으로 균주의 이름을 지정하고 균주 이름 열에 균주 이름을 입력합니다. 데이터를 처리하려면 Fulcrum 웹 사이트로 이동하여 Fulcrum 데이터베이스에서 원시 프로젝트 데이터를 내보냅니다. 새 R 스크립트를 열고 easyfulcrum 비네트의 지시에 따라 컬렉션 데이터를 처리합니다.
NBCI BLAST에서 S-Label S-05554의 결과는 최고 히트가 Caenorhabditis briggsae임을 보여줍니다. 또한, 일부 고립 된 선충류는 유전자형에 대한 추가 노력이 필요합니다. 예를 들어, 약 2%의 분리물은 첫 번째 용해 시도 후에 SSU PCR 프라이머 세트로 증폭되지 않으며, 용해 물질이 ITS2 프라이머 세트를 사용한 증폭에 적합한지 확인하기 위해 재용해되어야 한다.
이 절차에 따라 연구자들은 야생 선충류 분리 물과 관련된 생태 및 환경 데이터를 탐구하여 특정 선충류 종을 보유 할 가능성이 가장 높은 위치와 기질 특성을 식별 할 수 있습니다.
