Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Isolierung und Identifizierung von Caenorhabditis-Nematoden aus der Natur zu rationalisieren und wichtige ökologische und ökologische Daten im Zusammenhang mit der natürlichen Umgebung der Nematoden aufzuzeichnen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre Skalierbarkeit und Genauigkeit, die durch die Nutzung mobiler Datenerfassungsplattformen, Cloud-basierter Datenbanken und standardisierter Datenverarbeitungsfunktionen ermöglicht werden. Identifizieren Sie zunächst einen Ort, an dem Sie Caenorhabditis-Nematoden untersuchen können.
Um ein Fulcrum-Projekt zu erstellen, erstellen Sie ein Konto bei Fulcrum online mit einer kostenlosen Bildungsvereinbarung und fügen Sie die Nematoden-Feldprobenahmeanwendung hinzu. Fügen Sie dann die Anwendung zur Isolierung von Nematoden hinzu. Drucken Sie eine Reihe von QR-Code-Etiketten als C-Labels, um die Kollektionen zu verfolgen, und S-Labels, um die Nematodenisolationen zu verfolgen.
Befestigen Sie die C-Labels zum Verpacken an Ziploc Plastiktüten. Bewahren Sie den Satz S-Labels für den Einsatz im Labor auf. Wählen Sie die Nematodenfeldprobe aus dem Dropdown-Menü der mobilen Fulcrum-App aus und drücken Sie Plus, um einen neuen Datensatz im Projekt zu starten.
Machen Sie ein Foto des Substrats. Tippen Sie auf das Feld C-Label und wählen Sie Scannen. Scannen Sie den Barcode auf der Abholtasche mit der Kamera des Mobilgeräts und tippen Sie dann auf Fertig.
Tippen Sie auf das Feld Substrat und wählen Sie einen Substrattyp aus. Messen Sie die Oberflächentemperatur des Substrats mit dem berührungslosen Thermometer und notieren Sie den Wert im Substrattemperaturfeld. Messen und erfassen Sie auch die Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit.
Speichern und zeichnen Sie in Fulcrum auf, indem Sie oben links auf dem Bildschirm auf Speichern tippen. Sammeln Sie einen Esslöffel des Substrats ohne Stöcke oder andere harte Stücke, indem Sie den Auffangbeutel als Handschuh umdrehen, um das Substrat aufzunehmen, und verschließen Sie dann den Beutel. Beachten Sie für jede Ziploc-Tasche das C-Label auf der Tasche und befestigen Sie ein passendes C-Label am Deckel einer 10-Zentimeter-Platte, die mit OP50-Bakterien befleckt ist.
Geben Sie einen Esslöffel Probe aus jedem Sammelbeutel mit einem sauberen Plastiklöffel auf die C-Platten. Wählen Sie in der Anwendung Fulcrum im Anwendungsmenü die Option Nematodenisolation aus. Erstellen Sie dann einen neuen Isolationsdatensatz, indem Sie auf das Plus-Symbol unten rechts tippen.
Tippen Sie auf die Schaltfläche Auswählen, um das C-Label zu finden, das einer Probe zugeordnet ist. Tippen Sie auf das Suchsymbol. Tippen Sie dann auf das Scan-Symbol, um den C-Label QR-Code zu scannen.
Suchen Sie mit einem Seziermikroskop nach Nematoden auf der C-Platte. Tippen Sie auf die Würmer auf dem Probenfeld, um das Vorhandensein von Nematoden auf der Probe aufzuzeichnen. Wenn keine Nematoden vorhanden sind, verfilmen Sie die C-Platte und entsorgen Sie sie in einem Biohazard-Behälter.
Wenn Nematoden vorhanden sind, isolieren Sie bis zu fünf Nematoden von der C-Platte und übertragen Sie jede auf ihre eigene S-Platte. Tippen Sie anschließend auf das Feld S-beschriftete Platten, um die für diese Isolierung verwendete S-Platte einzugeben. Tippen Sie auf das Plus unten rechts.
Tippen Sie auf S-Label und dann auf Scannen, um die Gerätekamera zu öffnen, und scannen Sie dann den S-Label QR-Code auf dem S-Plate. Tippen Sie auf die Schaltfläche zum Speichern oben rechts, sobald der Isolationsdatensatz alle Informationen korrekt hinzugefügt hat, parafilmen Sie die S-Platten mit isolierten Nematoden und legen Sie sie in einem Bereich beiseite, der für die Aufnahme von S-Platten mit Nematoden bestimmt ist. Melden Sie sich auf der Fulcrum-Website an und wählen Sie die Nematoden-Isolationsanwendung aus.
Klicken Sie auf Exporter, um eine Zip-Datei herunterzuladen, die die Nematodenisolation s_labeled_plates enthält. CSV-Datei. Navigieren Sie zur Wild isolierten Genotypisierungsvorlage Google Sheet und kopieren Sie die Google Sheet.
Platzieren Sie die aus der Nematodenisolation kopierten S-Etiketten s_labeled_plates. CSV-Spalte in das Genotypisierungsblatt. Überprüfen Sie, ob sich die Tiere 48 Stunden nach der Isolierung auf S-Kennzeichen vermehren.
Wenn eine S-Platte wuchernde Tiere enthält, geben Sie eine in die Spalte Proliferation 48 im Genotypisierungsblatt ein und bewegen Sie die S-Platte dann in eine Box mit der Bezeichnung 48 hours proliferation box one. Überprüfen Sie die S-Kennzeichen, die sich 48 Stunden nach der Isolierung nicht vermehrt haben, 168 Stunden nach der Isolierung. Wenn sich jetzt eine S-Platte ausbreitet, geben Sie eine in die Spalte Proliferation 168 auf dem Genotypisierungsblatt ein und verschieben Sie dann die S-Platte in eine Box mit der Bezeichnung 168 hours proliferation box one.
Filtern Sie den Genotyp in Google Sheet, um nur die S-Labels in einer Proliferationsbox zu enthalten, die lysiert werden soll, und wählen Sie dann die Spalten S-Label über Lyseknoten aus. Drucken Sie ein Lyse-Arbeitsblatt für jede Proliferationsbox, die lysiert werden soll. Bereiten Sie 12 Bohrlochstreifenröhrchen für die zu lysierenden Proben vor.
Lösen Sie ein Streifenröhrchen und fügen Sie acht Mikroliter Lysepuffer zu jeder Kappe mit einem wiederholten Pipetter hinzu. Wählen Sie drei bis fünf Tiere von den Quellplatten in die auf dem Lyse-Arbeitsblatt angegebenen Kappenpositionen aus. Wiederholen Sie dies für bis zu acht Streifenrohre und legen Sie die Bandrohre in den minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank.
Entfernen Sie die Sätze von Streifenrohren und führen Sie das Lyseprogramm im Thermocycler aus. Dann lagern Sie die Lysate bei minus 80 Grad Celsius für bis zu einer Woche. Entfernen Sie die Streifenrohre aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und tauen Sie das Lysematerial auf Eis auf.
Während das Lysematerial auftaut, bereiten Sie ITS2- und SSU-Mastermischungen in separaten Röhrchen auf Eis vor. Mit einer mehrkanaligen Pipette mit geringem Volumen zwei Mikroliter Lysat in die entsprechende Vertiefung in der PCR-Platte geben. Führen Sie die PCRs mit dem entsprechenden Thermocycler-Programm aus und notieren Sie, welche S-Labels ITS2- oder SSU-PCR-Produkte in der Genotypisierungsfolie ergeben.
Verwenden Sie für jede Probe, die ITS2-positiv ist, das verbleibende ITS2-PCR-Produkt für die Sanger-Sequenzierung und rufen Sie die Seq-Ausgabedateien für jedes S-Label von der Sequenzierungsplattform ab. Navigieren Sie in einem Webbrowser zur NBCI BLAST-Website, um die BLAST-Suche zu starten. Für S-Platten-Sequenzen, die zu einer Caenorhabditis-Art BLAST-Sequenzen führen, geben Sie die vollständige Gattung und den Artnamen des obersten BLAST-Treffers in die Spalte mit der Art-ID ein.
Benennen Sie die Stämme mit eindeutigen Namen gemäß den Konventionen der Caenorhabditis-Nomenklatur und geben Sie die Sortennamen in die Spalte Stammname ein. Um die Daten zu verarbeiten, navigieren Sie zur Fulcrum-Website und exportieren Sie die Rohprojektdaten aus der Fulcrum-Datenbank. Öffnen Sie ein neues R-Skript und folgen Sie den Anweisungen in der easyfulcrum-Vignette, um die Erfassungsdaten zu verarbeiten.
In NBCI BLAST zeigen die Ergebnisse für S-Label S-05554, dass der Top-Hit Caenorhabditis briggsae ist. Darüber hinaus erfordern einige isolierte Nematoden zusätzlichen Aufwand für die Genotypisierung. Zum Beispiel können etwa 2% der Isolate nach dem ersten Lyseversuch nicht mit dem SSU-PCR-Primer-Set amplifizieren und müssen verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Lysematerial für die Amplifikation mit dem ITS2-Primer-Set geeignet ist.
Nach diesem Verfahren können Forscher die ökologischen und ökologischen Daten untersuchen, die mit wilden Nematodenisolaten verbunden sind, um Standorte und Substrateigenschaften zu identifizieren, die am ehesten bestimmte Nematodenarten beherbergen.
