Этот протокол может быть использован для оптимизации изоляции и идентификации нематод Caenorhabditis от природы и записи важных экологических и экологических данных, связанных с природной средой нематод. Основными преимуществами этого метода являются его масштабируемость и точность, которые становятся возможными благодаря использованию мобильных платформ сбора данных, облачных баз данных и стандартизированных функций обработки данных. Для начала определите место для обследования нематод Caenorhabditis.
Чтобы создать проект Fulcrum, создайте учетную запись в Fulcrum онлайн, используя бесплатное образовательное соглашение, и добавьте приложение для выборки нематод. Затем добавьте приложение для изоляции нематод. Распечатайте набор этикеток с QR-кодом как C-Labels для отслеживания коллекций и S-Labels для отслеживания изоляции нематод.
Прикрепите C-этикетки к пластиковым пакетам Ziploc для упаковки. Храните комплект S-этикеток для использования в лаборатории. Выберите выборку поля нематоды в раскрывающемся меню мобильного приложения Fulcrum и нажмите клавишу «плюс», чтобы начать новую запись в проекте.
Сфотографируйте подложку. Нажмите на поле C-Label и выберите сканирование. Отсканируйте штрих-код на сумке для сбора с помощью камеры мобильного устройства, затем нажмите «Готово».
Нажмите на поле подложки и выберите тип подложки. Измерьте температуру поверхности подложки с помощью бесконтактного термометра и запишите значение в поле температуры подложки. Также измеряйте и регистрируйте температуру и влажность окружающей среды.
Сохраните и запишите в Fulcrum, нажав на кнопку «Сохранить» в левом верхнем углу экрана. Соберите столовую ложку субстрата без палочек или других твердых кусочков, перевернув мешок для сбора в качестве перчатки, чтобы поднять подложку, а затем запечатайте пакет. Для каждой сумки Ziploc обратите внимание на C-Label на сумке и прикрепите соответствующую C-Label к крышке 10-сантиметровой пластины, обнаруженной бактериями OP50.
Переложите одну столовую ложку образца из каждого пакета для сбора на С-пластины с помощью чистой пластиковой ложки. В приложении Fulcrum выберите изоляция нематод в меню приложения. Затем создайте новую запись изоляции, коснувшись значка «плюс» в правом нижнем углу.
Нажмите на кнопку выбора, чтобы найти C-Label, связанный с образцом. Нажмите на значок поиска. Затем нажмите на значок сканирования, чтобы отсканировать QR-код C-Label.
Ищите нематод на С-пластине с помощью рассекающего микроскопа. Нажмите на червей на поле образца, чтобы зафиксировать присутствие нематод на образце. Если нематод нет, парафильмируйте С-пластину и утилизируйте ее в контейнер для биологической опасности.
Если нематоды присутствуют, изолируйте до пяти нематод из С-пластины и перенесите каждую в свою собственную S-пластину. Затем нажмите на поле S-labeled plates, чтобы ввести S-пластину, используемую для этой изоляции. Нажмите на плюс в правом нижнем углу.
Нажмите на S-Label, а затем нажмите на сканирование, чтобы открыть камеру устройства, затем отсканируйте QR-код S-Label на S-пластине. Нажмите на кнопку сохранения в правом верхнем углу после того, как запись изоляции будет правильно добавлена вся информация, затем парафилируйте пластины S с изолированными нематодами и отложите их в сторону в области, предназначенной для хранения S-пластин с нематодами. Войдите на веб-сайт Fulcrum и выберите приложение для изоляции нематод.
Нажмите на экспортера, чтобы загрузить ZIP-файл, содержащий s_labeled_plates изоляции нематод. csv файл. Перейдите к шаблону генотипирования дикого изолята Google Sheet и скопируйте Google Sheet.
Поместите S-метки, скопированные с изоляционного s_labeled_plates нематоды. столбец csv в лист генотипирования. Проверьте наличие размножающихся животных на S-пластинах через 48 часов после изоляции.
Если S-пластина имеет размножающихся животных, введите одну из них в колонку пролиферации 48 в листе генотипирования, а затем переместите S-пластину в коробку с маркировкой 48-часовой ящик для размножения. Проверьте S-пластины, которые не размножались через 48 часов после изоляции, снова через 168 часов после изоляции. Если S-пластина в настоящее время распространяется, введите ее в колонку 168 пролиферации на листе генотипирования, а затем переместите S-пластину в коробку с маркировкой 168 часов размножения.
Отфильтруйте генотип в Google Sheet, чтобы включить только S-метки в одно поле распространения для лизирования, затем выберите столбцы S-Label через узлы лизиса. Распечатайте лист лизиса для каждой коробки распространения, подлежащей лизированию. Подготовьте 12 луночных ленточных трубок для лизирования образцов.
Снимите крышку с одной ленточной трубки и добавьте восемь микролитров буфера лизиса к каждому колпачку с помощью повторного пипетки. Выберите от трех до пяти животных из исходных пластин в положения колпачка, указанные на листе лизиса. Повторите до восьми ленточных трубок и поместите ленточные трубки в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию.
Снимите наборы ленточных трубок и запустите программу лизиса в термоциклере. Затем храните лизаты при минус 80 градусах Цельсия до одной недели. Снимите ленточные трубки из морозильной камеры при минус 80 градусах Цельсия и разморозьте материал лизиса на льду.
Пока материал лизиса оттаивает, приготовьте мастер-миксы ITS2 и SSU в отдельных трубках на льду. Добавьте два микролитра лизата в соответствующую лунку в ПЦР-пластине с малообъемной многоканальной пипеткой. Запустите PCR с соответствующей программой термоциклера и запишите, какие S-этикетки дают продукты ITS2 или SSU PCR в листе генотипирования.
Для каждого образца, который является положительным по ITS2, используйте оставшийся продукт ITS2 PCR для секвенирования Сэнгера и получите выходные файлы seq для каждой S-Label с платформы секвенирования. Перейдите на веб-сайт NBCI BLAST в веб-браузере, чтобы начать поиск BLAST. Для последовательностей S-пластин, которые ВЗРЫВАЮТся для вида Caenorhabditis, введите полный род и название вида верхнего хита BLAST в колонке идентификатора вида.
Назовите штаммы уникальными именами, следуя номенклатурным соглашениям Caenorhabditis и введите названия штаммов в столбец названия штамма. Чтобы обработать данные, перейдите на веб-сайт Fulcrum и экспортируйте необработанные данные проекта из базы данных Fulcrum. Откройте новый сценарий R и следуйте инструкциям в виньетке easyfulcrum для обработки данных коллекции.
В NBCI BLAST результаты для S-Label S-05554 показывают, что лучшим хитом является Caenorhabditis briggsae. Кроме того, некоторые изолированные нематоды требуют дополнительных усилий для генотипирования. Например, примерно 2% изолятов не могут амплироваться с помощью набора праймеров SSU PCR после первой попытки лизиса и должны полагаться на то, что материал лизиса подходит для амплификации с помощью набора праймеров ITS2.
Следуя этой процедуре, исследователи могут исследовать экологические и экологические данные, связанные с изолятами диких нематод, чтобы определить места и характеристики субстрата, которые, скорее всего, содержат конкретные виды нематод.
