Este protocolo pode ser utilizado para agilizar o isolamento e identificação de nematoides caenorhabditis da natureza e registrar dados ecológicos e ambientais importantes associados ao ambiente natural dos nematoides. As principais vantagens dessa técnica são sua escalabilidade e precisão, que são possíveis aproveitando plataformas móveis de coleta de dados, bancos de dados baseados em nuvem e funções padronizadas de processamento de dados. Para começar, identifique um local para vistoriar nematoides caenorhabditis.
Para criar um projeto Fulcrum, crie uma conta com fulcrum on-line usando um contrato educacional sem custo e adicione a aplicação de amostragem de campo nematode. Em seguida, adicione a aplicação de isolamento de nematoide. Imprima um conjunto de etiquetas de código QR como C-Labels para rastrear as coleções e S-Labels para rastrear os isolamentos de nematoides.
Conecte as etiquetas C aos sacos plásticos Ziploc para embalagem. Mantenha o conjunto de Etiquetas S para uso em laboratório. Selecione a amostragem de campo nematode no menu suspenso do aplicativo móvel Fulcrum e pressione mais para iniciar um novo registro no projeto.
Tire uma foto do substrato. Toque no campo C-Label e escolha a varredura. Escaneie o código de barras no saco de coleta usando a câmera do dispositivo móvel e toque em feito.
Toque no campo do substrato e selecione um tipo de substrato. Meça a temperatura da superfície do substrato usando o termômetro sem contato e registe o valor no campo de temperatura do substrato. Também meça e regissite a temperatura ambiente e a umidade.
Salve e grave em Fulcrum tocando em salvar no canto superior esquerdo da tela. Colete uma colher de sopa do substrato sem varas ou outras peças duras invertendo o saco de coleta como uma luva para pegar o substrato e, em seguida, selar o saco. Para cada saco ziploc, observe o Rótulo C na bolsa e conecte um rótulo C correspondente à tampa de uma placa de 10 centímetros avistada com bactérias OP50.
Transfira uma colher de sopa de amostra de cada saco de coleta para os pratos C usando uma colher de plástico limpa. No aplicativo Fulcrum, escolha o isolamento nematode no menu do aplicativo. Em seguida, faça um novo registro de isolamento tocando no ícone plus no lado inferior direito.
Toque no botão de seleção para encontrar o rótulo C associado a uma amostra. Toque no ícone de pesquisa. Em seguida, toque no ícone de varredura para digitalizar o código QR de etiqueta C.
Procure nematoides na placa C com um microscópio dissecando. Toque nos vermes no campo de amostra para registrar a presença de nematoides na amostra. Se não houver nematoides, parabobofete a placa C e descarte-a em uma lixeira de risco biológico.
Se os nematoides estiverem presentes, isole até cinco nematoides da placa C e transfira cada um para sua própria placa S. Em seguida, toque no campo de placas com etiqueta S para entrar na placa S usada para este isolamento. Toque no plus no lado inferior direito.
Toque em S-Label e clique na digitalização para abrir a câmera do dispositivo e, em seguida, escaneie o código QR S-Label na placa S. Toque no botão de salvamento no canto superior direito uma vez que o registro de isolamento tenha todas as informações adicionadas corretamente, em seguida, parafilme as placas S com nematoides isolados e reserve-as em uma área designada para segurar placas S com nematoides. Entre no site da Fulcrum e selecione o aplicativo de isolamento nematode.
Clique no exportador para baixar um arquivo zip que contenha o isolamento nematode s_labeled_plates. arquivo csv. Navegue até o modelo de genotipagem do isolado selvagem Google Sheet e copie a Folha do Google.
Coloque os Rótulos S copiados do isolamento nematoide s_labeled_plates. coluna csv na folha de genotipagem. Verifique se os animais proliferam em placas S 48 horas após o isolamento.
Se uma placa S tiver animais proliferando, digite uma na coluna de proliferação 48 na folha de genotipagem, em seguida, mova a placa S para uma caixa rotulada 48 horas de caixa de proliferação uma. Verifique as placas S que não estavam se proliferando em 48 horas após o isolamento novamente às 168 horas após o isolamento. Se uma placa S estiver agora proliferando, digite uma na coluna de proliferação 168 na folha de genotipagem e, em seguida, mova a placa S para uma caixa rotulada 168 horas de proliferação uma caixa.
Filtre o genótipo no Google Sheet para incluir apenas os Rótulos S em uma caixa de proliferação a ser lise e selecione as colunas S-Label através de nódulos de lise. Imprima uma planilha de lise para que cada caixa de proliferação seja líseda. Prepare 12 tubos de tira de poço para que as amostras sejam líspidas.
Despreste um tubo de tira e adicione oito microliters de tampão de lise a cada tampa com uma pipetter repetida. Escolha de três a cinco animais das placas de origem para as posições da tampa indicadas na planilha de lise. Repita por até oito tubos de tira e coloque os tubos de tira no congelador de menos 80 graus Celsius.
Remova os conjuntos de tubos de tira e execute o programa de lise no termociclador. Em seguida, armazene os lises a menos 80 graus Celsius por até uma semana. Remova os tubos de tira do congelador de menos 80 graus Celsius e descongele o material de lise no gelo.
Enquanto o material de lise está descongelando, prepare as misturas mestre ITS2 e SSU em tubos separados no gelo. Adicione dois microliters de lise ao poço apropriado na placa PCR com uma pipeta multicanal de baixo volume. Execute os PCRs com o programa termociclador apropriado e grave quais etiquetas S produzem produtos PCR ITS2 ou SSU na folha de genotipagem.
Para cada amostra que seja ITS2 positiva, use o produto PCR ITS2 restante para sequenciamento Sanger e obtenha os arquivos de saída seq para cada S-Label da plataforma de sequenciamento. Navegue até o site da NBCI BLAST em um navegador da Web para iniciar a pesquisa blast. Para sequências de placas S que BLAST para uma espécie de Caenorhabditis, entre no gênero completo e nome da espécie do topo BLAST atingido na coluna de ID da espécie.
Nomeie as cepas com nomes únicos, seguindo convenções de nomenclatura de Caenorhabditis e digite os nomes de tensão na coluna de nome da cepa. Para processar os dados, navegue até o site da Fulcrum e exporte os dados brutos do projeto a partir do banco de dados Fulcrum. Abra um novo script R e siga as instruções da vinheta easyfulcrum para processar os dados de coleta.
Na NBCI BLAST, os resultados do S-Label S-05554 mostram que o maior sucesso é Caenorhabditis briggsae. Além disso, alguns nematoides isolados requerem esforço adicional para genótipo. Por exemplo, aproximadamente 2% dos isolados não conseguem amplificar com o primer SSU PCR definido após a primeira tentativa de lise e devem ser confiados para garantir que o material de lise seja adequado para amplificação com o conjunto de primer ITS2.
Após esse procedimento, os pesquisadores podem explorar os dados ecológicos e ambientais associados aos isolados de nematoides selvagens para identificar locais e características de substratos que são mais propensos a abrigar espécies específicas de nematoides.
