يمكن استخدام هذا البروتوكول لتبسيط عزل وتحديد الديدان الخيطية Caenorhabditis من الطبيعة وتسجيل البيانات الإيكولوجية والبيئية الهامة المرتبطة بالبيئة الطبيعية للديدان الخيطية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي قابليتها للتوسع ودقتها ، والتي أصبحت ممكنة من خلال الاستفادة من منصات جمع البيانات المتنقلة ، وقواعد البيانات المستندة إلى السحابة ، ووظائف معالجة البيانات الموحدة. للبدء ، حدد موقعا لمسح الديدان الخيطية Caenorhabditis.
لإنشاء مشروع Fulcrum ، قم بإنشاء حساب مع Fulcrum عبر الإنترنت باستخدام اتفاقية تعليمية بدون تكلفة وأضف تطبيق أخذ العينات الميدانية للديدان الخيطية. ثم أضف تطبيق عزل الديدان الخيطية. اطبع مجموعة من تسميات رمز الاستجابة السريعة ك C-Labels لتتبع المجموعات و S-Labels لتتبع عزلات الديدان الخيطية.
قم بإرفاق C-Labels بأكياس Ziploc البلاستيكية للتعبئة. احتفظ بمجموعة S-Labels لاستخدامها في المختبر. حدد أخذ عينات حقل الديدان الخيطية من القائمة المنسدلة لتطبيق Fulcrum للجوال واضغط على علامة الجمع لبدء سجل جديد في المشروع.
التقط صورة للركيزة. اضغط على حقل C-Label واختر المسح الضوئي. امسح الرمز الشريطي الموجود على حقيبة التجميع باستخدام كاميرا الجهاز المحمول، ثم اضغط على تم.
اضغط على حقل الركيزة وحدد نوع الركيزة. قم بقياس درجة حرارة سطح الركيزة باستخدام مقياس الحرارة غير المتصل وسجل القيمة في حقل درجة حرارة الركيزة. قم أيضا بقياس وتسجيل درجة الحرارة والرطوبة المحيطة.
احفظ وسجل في Fulcrum من خلال النقر على حفظ في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة. اجمع ملعقة كبيرة من الركيزة بدون عصي أو قطع صلبة أخرى عن طريق عكس كيس التجميع كقفاز لالتقاط الركيزة ، ثم قم بإغلاق الحقيبة. لكل حقيبة Ziploc ، لاحظ C-Label على الحقيبة وأرفق C-Label مطابقا بغطاء لوحة 10 سم مرقطة ببكتيريا OP50.
انقل ملعقة كبيرة من العينة من كل كيس تجميع إلى ألواح C باستخدام ملعقة بلاستيكية نظيفة. في تطبيق Fulcrum ، اختر عزل الديدان الخيطية من قائمة التطبيق. ثم قم بإنشاء سجل عزل جديد من خلال النقر على أيقونة علامة الجمع في أسفل اليسار.
اضغط على زر التحديد للعثور على C-Label المرتبط بعينة. اضغط على أيقونة البحث. ثم اضغط على أيقونة المسح الضوئي لمسح رمز الاستجابة السريعة C-Label.
ابحث عن الديدان الخيطية على اللوحة C باستخدام مجهر تشريح. اضغط على الديدان في حقل العينة لتسجيل وجود الديدان الخيطية على العينة. في حالة عدم وجود ديدان خيطية ، قم بتصوير لوحة C والتخلص منها في صندوق خطر بيولوجي.
في حالة وجود الديدان الخيطية ، اعزل ما يصل إلى خمسة ديدان خيطية من اللوحة C وانقل كل منها إلى لوحة S الخاصة بها. بعد ذلك ، انقر فوق حقل اللوحات التي تحمل علامة S للدخول إلى لوحة S المستخدمة في هذا العزل. اضغط على علامة الجمع في أسفل اليمين.
اضغط على S-Label ثم انقر فوق المسح الضوئي لفتح كاميرا الجهاز ، ثم قم بمسح رمز الاستجابة السريعة S-Label ضوئيا على لوحة S. اضغط على زر الحفظ في الجزء العلوي الأيمن بمجرد أن يحتوي سجل العزل على جميع المعلومات المضافة بشكل صحيح ، ثم قم بتصوير لوحات S مع الديدان الخيطية المعزولة ووضعها جانبا في منطقة مخصصة لحمل لوحات S مع الديدان الخيطية. سجل الدخول إلى موقع Fulcrum على الويب وحدد تطبيق عزل الديدان الخيطية.
انقر فوق المصدر لتنزيل ملف مضغوط يحتوي على عزل الديدان الخيطية s_labeled_plates. ملف csv. انتقل إلى قالب التنميط الجيني المعزول البري Google Sheet وانسخ ورقة Google.
ضع S-Labels المنسوخة من عزل الديدان الخيطية s_labeled_plates. عمود csv في ورقة التنميط الجيني. تحقق من انتشار الحيوانات على ألواح S بعد 48 ساعة من العزل.
إذا كانت الصفيحة S تحتوي على منتشرة، فأدخل واحدة في عمود الانتشار 48 في ورقة التنميط الجيني، ثم انقل الصفيحة S إلى صندوق يحمل علامة 48 ساعة مربع الانتشار الأول. تحقق من لوحات S التي لم تكن تنتشر في 48 ساعة بعد العزل مرة أخرى في 168 ساعة بعد العزل. إذا كانت الصفيحة S تتكاثر الآن، فأدخل واحدة في عمود الانتشار 168 على ورقة التنميط الجيني ثم انقل الصفيحة S إلى صندوق يسمى مربع الانتشار 168 ساعة الأول.
يمكنك تصفية النمط الوراثي في "ورقة Google" لتضمين S-Labels فقط في مربع انتشار واحد ليتم تحليله، ثم حدد الأعمدة S-Label من خلال عقد التقسيم. طباعة ورقة عمل تحلل لكل مربع انتشار ليتم تحليلها. قم بإعداد 12 أنبوبا شريطيا جيدا لتحليل العينات.
قم بفك أنبوب شريط واحد وأضف ثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل غطاء باستخدام أنبوب متكرر. اختر ثلاثة إلى خمسة من لوحات المصدر إلى مواضع الغطاء المشار إليها في ورقة عمل التحلل. كرر ذلك لمدة تصل إلى ثمانية أنابيب شريطية وضع الأنابيب الشريطية في الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بإزالة مجموعات أنابيب الشريط وقم بتشغيل برنامج التحلل في جهاز التدوير الحراري. ثم قم بتخزين الليزات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع واحد. قم بإزالة أنابيب الشريط من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة مادة التحلل على الجليد.
بينما تذوب مادة التحلل ، قم بإعداد مزيج ITS2 و SSU الرئيسي في أنابيب منفصلة على الجليد. أضف ميكرولترين من الليزات إلى البئر المناسب في لوحة PCR باستخدام ماصة متعددة القنوات منخفضة الحجم. قم بتشغيل PCRs باستخدام برنامج التدوير الحراري المناسب وسجل أي S-Labels تنتج منتجات ITS2 أو SSU PCR في ورقة التنميط الجيني.
لكل عينة إيجابية ITS2 ، استخدم منتج ITS2 PCR المتبقي لتسلسل Sanger واحصل على ملفات إخراج seq لكل S-Label من النظام الأساسي للتسلسل. انتقل إلى موقع NBCI BLAST على الويب في متصفح ويب لبدء البحث عن BLAST. بالنسبة لتسلسلات لوحة S التي تنفجر إلى نوع Caenorhabditis ، أدخل اسم الجنس والأنواع الكامل لأعلى ضربة BLAST في عمود معرف الأنواع.
قم بتسمية السلالات بأسماء فريدة، وفقا لاصطلاحات تسمية Caenorhabditis وأدخل أسماء السلالات في عمود اسم السلالة. لمعالجة البيانات، انتقل إلى موقع Fulcrum على الويب وقم بتصدير بيانات المشروع الخام من قاعدة بيانات Fulcrum. افتح برنامج نصي R جديدا واتبع الإرشادات الواردة في المقالة القصيرة easyfulcrum لمعالجة بيانات التجميع.
في NBCI BLAST ، تظهر نتائج S-Label S-05554 أن أعلى نتيجة هي Caenorhabditis briggsae. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب بعض الديدان الخيطية المعزولة جهدا إضافيا للنمط الوراثي. على سبيل المثال ، يفشل ما يقرب من 2٪ من العزلات في التضخيم مع مجموعة التمهيدي SSU PCR بعد محاولة التحلل الأولى ويجب الاعتماد عليها للتأكد من أن مادة التحلل مناسبة للتضخيم باستخدام مجموعة التمهيدي ITS2.
بعد هذا الإجراء ، يمكن للباحثين استكشاف البيانات الإيكولوجية والبيئية المرتبطة بعزلات الديدان الخيطية البرية لتحديد المواقع وخصائص الركيزة التي من المرجح أن تؤوي أنواعا معينة من الديدان الخيطية.
