Estos protocolos están diseñados para maximizar la recuperación y la pureza de las proteínas a través de la precipitación a base de solventes. Vamos a mostrarte un par de trucos para realizar la precipitación en viales, así como un enfoque semiautomático en formato de cartucho de centrifugado. También hemos optimizado el protocolo de precipitación para que sea consistente y rápido.
Todo el protocolo solo toma unos minutos. Estos protocolos demuestran que la precipitación con disolventes de proteínas es ideal para la preparación de muestras antes de la espectrometría de masas. Los protocolos encajarán perfectamente en los flujos de trabajo profesionales de abajo hacia arriba y de arriba hacia abajo.
Demostrando para nosotros hoy estarán Ziheng Dang y Victoria Miller, científica principal de Proteoform Scientific en Halifax, Nueva Escocia Pipetear 90 microlitros de solución de proteína libre de partículas en un tubo de microcentrífuga de polipropileno. Luego agregue 10 microlitros de un mol de cloruro de sodio acuoso y 400 microlitros de acetona en la solución de muestra, tapa y golpee suavemente el vial para combinar los solventes. Deje que el vial lo incube.
Temperatura ambiente inalterada durante un mínimo de dos minutos después de la incubación, centrifugar las muestras observando la orientación del vial y girar durante un mínimo de dos minutos a 10, 000 RCF o más a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se observa una bolita blanca visible en el fondo del tubo. En este punto, destapa el tubo y decanta el sobrenado en un contenedor de residuos invirtiendo el tubo.
Use una toalla de papel para extraer cualquier solvente residual del vial. Para SDS que contienen muestras. Dispense cuidadosamente 400 microlitros de acetona fresca sin alterar el pellet.
Inmediatamente centrar la muestra durante un minuto a 10, 000 veces G o más a temperatura ambiente colocando el vial en el rotor en la misma orientación que el giro inicial. Calcule el disolvente de lavado como se describió anteriormente. Seque la muestra con la tapa abierta durante aproximadamente un minuto.
En una campana extractora, antes de una solubilización de pellets. Dispense 100 microlitros de la solución de proteína en un vial de polipropileno. En la campana extractora, agregue 400 microlitros de metanol seguido de 100 microlitros de cloroformo.
Tapa el vial y el vórtice brevemente para mezclar. Dispense rápidamente 300 microlitros de agua directamente en el centro del vial. Tapar el vial y dejarlo reposar en la mesa de trabajo sin ser molestado durante un minuto, después de colocar el vial de polipropileno en una centrífuga y girarlo durante cinco minutos a 10, 000 veces G o más a temperatura ambiente.
Se observa que el vial tiene dos capas de disolvente y un pellet blanco visible hasta que el vial esté a aproximadamente 45 grados. Retire aproximadamente 700 microlitros del disolvente de la capa superior a una velocidad uniforme utilizando una punta de micropipeta grande de un mililitro inicialmente y más tarde con una punta de pipeta de 200 microlitros hasta que forme una perla en el vial. Agregue 400 microlitros de metanol fresco al vial de muestra sin alterar el pellet dispensando el disolvente por el costado del vial.
Tapa el vial y combina las capas de disolvente balanceando suavemente el vial para agitar los disolventes juntos. Para observar el pellet de proteína blanca observando la orientación del vial en la centrífuga del rotor durante un mínimo de 10 minutos a 10, 000 veces G o más a temperatura ambiente. Incline el vial con el pellet hacia abajo.
Coloque una punta de pipeta a lo largo del borde superior del vial y retire el sobrenadante con una punta de micropipeta de un mililitro a una velocidad lenta pero uniforme. Reteniendo aproximadamente 20 microlitros de disolvente. Deje que el disolvente residual se seque en la campana extractora.
Para precipitar la proteína. Con un cartucho de filtración desechable, fije el tapón al cartucho de filtración superior. Combine 90 microlitros de solución de proteína 10 microlitros de un mol aquas, cloruro de sodio y 400 microlitros de acetona.
Incubar durante un mínimo de dos minutos en la mesa de sobremesa, centrifugar la muestra de proteína preparada con el tapón todavía conectado al cartucho de filtración durante dos minutos a 2, 500 veces G.At temperatura ambiente, invertir el cartucho y desenroscar y retirar el tapón de la base del cartucho. Coloque el cartucho de filtración en un vial limpio centrifugar la muestra de proteína durante tres minutos a 500 veces G a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través del disolvente del vial inferior.
Lave el pellet de proteína agregando 400 microlitros de acetona al cartucho de filtración, centrifugar durante tres minutos a 500 veces G a temperatura ambiente o hasta que no quede disolvente en el cartucho superior. Siguiendo los protocolos de precipitación de proteínas previamente demostrados. Resolubilizar la proteína humedeciendo la membrana en la base del cartucho de filtración dispensando de dos a cinco microlitros de ISO propanol directamente a la membrana inmediatamente antes de proceder al protocolo de resolubilización para la resolubilización del pellet de proteína preparar 80% volumen por volumen solución de ácido fórmico en agua.
Pre enfríe esta solución ácida a menos 20 grados centígrados y el cartucho de filtración que contiene proteína precipitada. Dispense 50 microlitros de ácido fórmico diluido en frío en la tapa del cartucho refrigerado y el vórtice durante 30 segundos. Devuelva el cartucho de filtración al congelador a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos.
Repita los pasos anteriores de vórtice e incubación. Agregue 450 microlitros de agua a un volumen final de 500 microlitros. Diluir el ácido fórmico al 8%Invierta el cartucho, desenrosque y retire el tapón de la base del cartucho y conecte el cartucho SPE al vial.
Girar la proteína a través del cartucho SPE en una centrífuga a temperatura ambiente durante cinco minutos a 800 veces G.Si queda disolvente en el cartucho superior, devuelva el cartucho a la centrífuga y repita el centrifugado. Enjuague agregando 300 microlitros de 5% de acetonitrilo con 0.1% de TFA en agua al cartucho SPE, fluya a través del cartucho SPE durante dos minutos a 2000 veces G. Para proteínas de bajo peso molecular o péptidos digeridos eluya la muestra fluyendo 300 microlitros. Un 50% de acetonitrilo con 0,1% de TFA durante cinco minutos a 2, 500 veces G. Para proteínas intactas.
Siga con un paso de elusion adicional utilizando 300 microlitros de acetonitrilo al 75% con ácido ascético trifluoro al 0,1%. Combine los dos extractos resultantes. La figura compara el agotamiento de SDS después de la precipitación de proteínas en un cartucho de filtro desechable.
Uso de acetona con los protocolos convencionales rápidos y CMW. Todos los enfoques reducen la SDS para permitir un análisis óptimo de espectrometría de masas. Esta figura muestra la recuperación cuantitativa de proteínas siguiendo la precipitación rápida de acetona y la precipitación de CMW a través del análisis de la página SDS de un lisado celular total de levadura procesada.
Se obtuvo una recuperación consistente con todos los protocolos de precipitación. La precipitación en un cartucho de filtración desechable elimina la necesidad de pipetear cuidadosamente SDS que contiene sobrenadante mientras se retienen las proteínas agregadas por encima de un filtro de membrana. Por lo tanto, no se detectaron bandas visibles en las fracciones sobrenadantes en tres réplicas independientes.
La precipitación de proteínas basada en cartuchos demuestra una recuperación superior de una muestra digerida de pepsina de plasma bovino en relación con la precipitación basada en viales. Se observan diferencias más significativas en el rendimiento en el cartucho cuando se emplea cloruro de sodio, mientras que el empleo de disolvente de zinc da como resultado el mayor rendimiento. Esta figura cuantifica la intensidad máxima del péptido de cada muestra de péptido con una proporción superior a uno que refleja una mayor abundancia de péptidos para las muestras procesadas en los cartuchos de filtro desechables.
La figura compara el número de péptidos identificados por proteína en las tres preparaciones de muestra replicadas. Los coeficientes de correlación de 0,94 a 0,95 en estos gráficos demuestran la alta consistencia del enfoque de preparación de muestras para el análisis de espectrometría de masas ascendente. Entonces, una vez que se forma ese pellet, realmente quieres evitar molestarlo.
Si lo mantienes como un pellet intacto, obtendrás un mayor rendimiento. Así que asegúrate de no olvidar lavar ese pellet con acetona extra. Esto es asegurarnos de que nos estamos deshaciendo de la SDS manteniendo nuestra muestra lo más limpia posible y eso nos da el mejor análisis de espectrometría de masas.
Así que descubrimos que eliminar el exceso de disolvente invirtiendo el es mucho más simple que tratar de pipetear la muestra. Obtendrá rendimientos más consistentes de esta manera. La realización de la precipitación de acetona a temperatura ambiente resultó en una recuperación más consistente y rápida que la precipitación tradicional en el congelador.
