长期培养用人心肌组织的制备

使用该方案，可以在仿生室中离体培养人左心室组织切片。前负荷和后负荷的应用改善了生理环境的相似性。该技术允许组织收缩的连续配准。

用户定义的刺激方案允许评估重要的收缩参数，如暂停后电位、刺激阈值、力-频率关系和不应期。使用这种设置长期培养心肌切片将为未来的离体研究铺平道路，促进心血管医学中治疗和心脏毒性药物作用的筛选。首先，将培养室和石墨电极浸入一升10%异丙醇溶液中并搅拌过夜。

第二天，将腔室转移到100%异丙醇溶液中3分钟，然后让腔室和石墨电极在层流罩下风干。根据摇臂上的可用位置将电路板连接到每个腔室。按照制造商的说明将两个石墨电极放在电路板上，然后在腔室上放置一个35毫米的培养皿盖以防止感染。

接下来，用切片缓冲液填充切割托盘，最高可达90%至95%。将组织样品转移到充满冷切片缓冲液的100毫米培养皿中，并将培养皿置于4摄氏度的冷却板上。用镊子握住心内膜，取出心内膜小梁，然后用剪刀切除约3毫米的心内膜组织。

使用四根固定在方形位置的0.9 x 70毫米20号针，将心内膜的切口组织样本固定在2×2厘米的橡胶贴片上。确保每个针尖的对角线边缘指向内部，增强固定并防止心肌损伤。使用手术刀，切掉四个针方块外的所有多余组织。

使用镊子，将修剪后的样品放在无菌的组织上10秒钟，以除去多余的切片缓冲液。接下来，从水浴中取出琼脂糖注射器，并将样品浸没在琼脂糖中。让琼脂糖在冷却板上固化五分钟。

样本的心内膜侧必须在琼脂糖中可见。使用镊子，将琼脂糖中所含样品的外胚层侧放在胶合区域的顶部，然后用钝器从顶部轻轻按压含琼脂糖的样品，而不会切割或损坏琼脂糖。让胶水凝固1分钟。

将振动幅度设置为1毫米，初始切割速度设置为每秒0.07毫米，切片厚度设置为300微米。将栽培系统连接到计算机后，启动相应的软件程序。将摇臂速度设置为60 rpm并预设刺激参数。

对于人体心脏切片，将标准刺激设置为双相脉冲，50毫安或电流由3毫秒的正电流，1毫秒的停顿和3毫秒的倒置电流脉冲组成，起搏速率为每分钟30次或bpm，然后检查软件的电极指示器并验证培养室的电极是否正常工作。使用镊子，将琼脂糖从组织中分离出来。避免触摸组织并小心处理，因为对组织的任何损坏都会降低培养的成功率。

要将两个塑料三角形连接到样品上，请将1微升胶水放在无菌培养皿盖上。使用钩式镊子拿起一个高压灭菌的塑料三角形。快速将三角形的前边缘浸入胶水中，并将三角形粘贴到垂直于心肌细胞排列的样品上。

对另一个三角形重复上述步骤。使用手术刀，修剪掉超过三角形宽度的组织，并将带有两个安装的三角形的切片放回包含切片缓冲液的切割托盘中。从培养箱中取出培养基填充的培养室。

选择一个准备好的切片，并通过将一个三角形连接到每个引脚将其插入腔室中。根据样品尺寸调整安装销之间的距离。确保样品浸没在培养基中。

将培养皿放在摇臂上后，通过逆时针旋转调节螺钉来降低预载荷，直到计算机屏幕上相应图形的基线不再变化，然后通过顺时针旋转调节螺钉来小心地增加预载荷或张力。对于具有高刚度的腔室，请继续操作，直到图中相应的基线增加了 1， 000 到 1， 200 个单位，对应于 1 毫牛顿预载荷。制备新鲜培养基后，将培养基在37摄氏度的水浴或热风培养箱中预热30至45分钟。

从腔室中取出培养基，在腔室中留下约0.8毫升，然后向同一腔室中加入1.6毫升新鲜培养基，使培养基的总体积达到2.4毫升。最后，将腔室的盖子放回原处，并将培养室置于其各自的位置。在典型刺激期间，五个心肌切片收缩的读数由停顿后增强、刺激阈值、力-频率关系和不应期的四个不同部分组成。

与对照相比，用钙拮抗剂硝苯地平和钙西肽处理的切片的收缩力在10分钟内降低。相反，电压门控钙通道激动剂Bay-K8644增加了收缩力。评估对照组和处理切片的暂停后增强，以监测肌质网的细胞内钙释放情况。

控件切片未显示任何更改。在钙西肽和硝苯地平的存在下，L型钙通道的抑制导致停顿50秒后第一次收缩的增强，反映了细胞内钙释放对总收缩力的较高相对贡献。在Bay-K8644中观察到相反的效果，它刺激细胞外钙通过L型钙通道进入。

在力-频率关系分析中，对照切片未观察到变化。在比较治疗前和治疗后的数据时，钙西肽治疗没有改变切片在刺激频率增加时跟随刺激的能力。与卡西西汀相比，硝苯地平在较高的起搏率下阻止了收缩力的增加，并在80 bpm时降低了最大捕获率。

使用Bay-K8644，观察到在非常低的刺激频率下收缩力增加。然而，在频率高于50 bpm时，收缩力低于治疗前的条件。切除的组织应迅速转移到 4 度心脏麻痹。

切片后，塑料三角形必须垂直于光纤方向连接。预载荷不应超过1500毫牛顿。仿生切片培养可以帮助研究人员利用遗传操作以及基于细胞的疗法来研究成人心肌的再生和修复。