이 프로토콜을 사용하여, 인간 좌심실 조직 절편은 생체모방 챔버에서 생체외 배양될 수 있다. 사전 및 후부하의 적용은 생리 환경의 유사성을 향상시킵니다. 이 기술은 조직 수축의 지속적인 등록을 허용합니다.
사용자 정의 자극 프로토콜은 일시정지 후 강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터의 평가를 허용한다. 이 설정을 사용하여 심근 조각의 장기간 재배는 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한이 스크리닝을 용이하게하여 향후 생체 외 연구를위한 길을 열어 줄 것입니다. 시작하려면 배양 챔버와 흑연 전극을 10 % 이소프로판올 용액 1 리터에 담그고 밤새 교반하십시오.
다음날 챔버를 100 % 이소프로판올 용액으로 3 분 동안 옮긴 다음 챔버 및 흑연 전극을 층류 후드 하에서 공기 건조시킵니다. 로커의 사용 가능한 위치에 따라 회로 기판을 각 챔버에 부착하십시오. 제조업체의 지침에 따라 회로 기판에 두 개의 흑연 전극을 놓은 다음 감염을 예방하기 위해 챔버에 35mm 페트리 접시 뚜껑을 놓습니다.
그런 다음 절단 트레이를 슬라이싱 버퍼로 최대 90 ~ 95 %까지 채 웁니다. 조직 샘플을 차가운 슬라이싱 버퍼로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시에 옮기고 접시를 섭씨 4도의 냉각 플레이트에 놓습니다. 핀셋으로 심내막을 잡고 심내막 섬유주를 제거한 다음 가위를 사용하여 약 3mm의 심내막 조직을 잘라냅니다.
절단된 조직 샘플, 심내막 측면을 정사각형 위치에 고정된 네 개의 0.9x70밀리미터 20게이지 바늘을 사용하여 2x2센티미터 고무 패치까지 고정시킨다. 각 바늘 팁의 대각선 가장자리가 안쪽을 향하고 있는지 확인하여 고정력을 강화하고 심근 손상을 방지하십시오. 메스를 사용하여 네 개의 바늘 사각형 외부의 모든 과도한 조직을 잘라냅니다.
핀셋을 사용하여 트리밍된 샘플을 멸균된 조직 조각에 10초 동안 올려 놓고 과도한 슬라이싱 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 수조에서 아가로스 주사기를 제거하고 샘플을 아가로스에 침수시킨다. 아가로스를 냉각판에서 다섯 분 동안 응고시키십시오.
샘플의 심내막 측면은 아가로스에서 볼 수 있어야합니다. 핀셋을 사용하여 아가로스에 포함 된 샘플의 심외경면을 접착 된 부위 위에 놓은 다음 아가로스를 자르거나 손상시키지 않고 무딘 도구로 상단에서 아가로스 함유 샘플을 부드럽게 누릅니다. 접착제가 1 분 동안 굳어지게하십시오.
진동 진폭을 1mm로, 초기 절삭 속도를 초당 0.07mm로, 슬라이스 두께를 300미크론으로 설정합니다. 재배 시스템을 컴퓨터에 연결 한 후 해당 소프트웨어 프로그램을 시작하십시오. 로커 속도를 60rpm으로 설정하고 자극 매개 변수를 미리 설정합니다.
인간의 심장 조각의 경우, 표준 자극을 50 밀리암페어 또는 3 밀리 초 양의 전류, 1 밀리 초 일시 중지 및 분당 30 비트 또는 bpm의 간격 속도로 반전 전류의 3 밀리 초 펄스로 구성된 이단계 임펄스로 설정 한 다음 소프트웨어의 전극 표시기를 확인하고 재배 챔버의 전극이 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 핀셋을 사용하여 아가로스를 조직에서 분리하십시오. 조직을 만지지 말고 조직의 손상이 배양의 성공률을 떨어 뜨릴 수 있으므로 조심스럽게 다루십시오.
두 개의 플라스틱 삼각형을 샘플에 부착하려면 멸균 된 Petri 접시 뚜껑에 1 마이크로 리터의 접착제를 놓습니다. 후크 핀셋을 사용하여 오토클레이브 플라스틱 삼각형 하나를 집어 들으십시오. 삼각형의 앞 가장자리를 접착제에 빠르게 담그고 삼각형을 심근 세포 정렬에 수직인 샘플에 붙여 넣으십시오.
다른 삼각형에 대해 반복합니다. 메스를 사용하여 삼각형 너비를 초과하는 조직을 트리밍하고 두 개의 장착된 삼각형이 있는 슬라이스를 슬라이스 버퍼가 있는 절단 트레이에 다시 놓습니다. 배지가 채워진 배양 챔버를 인큐베이터로부터 제거한다.
준비된 슬라이스 하나를 선택하고 각 핀에 삼각형 하나를 연결하여 챔버에 삽입합니다. 장착 핀 사이의 거리를 샘플 크기로 조정합니다. 샘플이 배지에 잠겨 있는지 확인하십시오.
접시를 로커에 놓은 후 컴퓨터 화면의 해당 그래프의 기준선이 더 이상 변경되지 않을 때까지 조정 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 프리로드를 줄인 다음 조정 나사를 시계 방향으로 돌려 프리로드 또는 장력을 조심스럽게 높입니다. 강성이 높은 챔버의 경우, 그래프의 해당 기준선이 1밀리뉴턴 프리로드에 해당하는 1, 000 ~ 1, 200 단위만큼 증가할 때까지 계속하십시오. 신선한 재배 배지를 준비한 후, 배지를 섭씨 37도의 수조 또는 열풍 배양기에서 30 내지 45분 동안 미리 가온한다.
챔버에서 매체를 제거하고 챔버에 약 0.8 밀리리터를 남긴 다음 동일한 챔버에 1.6 밀리리터의 신선한 배지를 추가하여 챔버 당 2.4 밀리리터의 총 부피를 만듭니다. 마지막으로, 챔버의 덮개를 다시 놓고 재배 챔버를 각각의 위치에 놓습니다. 전형적인 자극 동안 다섯 개의 심근 슬라이스의 수축에 대한 판독은 일시 중지 후 강화, 자극 임계 값, 힘 - 주파수 관계 및 난치성 기간의 네 가지 별개의 섹션으로 구성되었습니다.
대조군과 비교하여, 칼슘 길항제인 니페디핀 및 칼시셉틴으로 처리된 슬라이스의 수축력은 10분 이내에 감소하였다. 대조적으로, 전압-게이팅된 칼슘 채널 작용제인 Bay-K8644는 수축력을 증가시켰다. 대조군 및 처리된 슬라이스의 일시정지 후 강화를 사르코플라스마 망상체로부터의 세포내 칼슘 방출에 대해 평가하였다.
컨트롤 조각에 변경 내용이 표시되지 않았습니다. 칼시셉틴과 니페디핀의 존재 하에서, L형 칼슘 채널의 억제는 50초의 정지 후 첫 번째 수축의 강화로 이어졌고, 이는 전체 수축성에 대한 세포내 칼슘 방출의 더 높은 상대적 기여를 반영한다. 반대 효과는 L형 칼슘 채널을 통해 세포외 칼슘의 진입을 자극하는 Bay-K8644에서 관찰되었다.
힘-주파수 관계 분석에서, 제어 슬라이스에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 칼시셉틴 처리는 치료 전후 데이터를 비교할 때 자극 빈도의 증가시 자극을 따르는 슬라이스의 능력을 변화시키지 않았다. 칼시셉틴과 비교했을 때, 니페디핀은 더 높은 페이싱 속도에서 수축성의 증가를 방지하고 80bpm에서 최대 포획률을 감소시켰다.
Bay-K8644에서는 매우 낮은 자극 주파수에서 수축력 증가가 관찰되었습니다. 그러나, 50 bpm보다 높은 주파수에서, 수축력은 전처리 조건에서보다 낮았다. 적출 된 조직은 4 도의 심장 흉막으로 신속하게 옮겨야합니다.
슬라이스 후 플라스틱 삼각형은 섬유 방향에 수직으로 부착되어야합니다. 프리로드는 1500밀리뉴턴을 초과해서는 안 됩니다. 생체 모방 슬라이스 배양은 연구자가 성인 인간 심근의 재생 및 복구를 연구하기위한 세포 기반 치료법뿐만 아니라 유전자 조작을 활용하는 데 도움이 될 수 있습니다.
