Bu protokolü kullanarak, insan sol ventrikül dokusu dilimleri biyomimetik bir odada ex vivo olarak yetiştirilebilir. Ön ve son yüklerin uygulanması, fizyolojik ortamın benzerliğini arttırır. Bu teknik, doku kasılmasının sürekli olarak kaydedilmesini sağlar.
Kullanıcı tanımlı stimülasyon protokolleri, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter dönem gibi hayati kasılma parametrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu kurulumu kullanarak miyokard dilimlerinin uzun süreli ekimi, gelecekteki ex vivo araştırmaların yolunu açacak ve kardiyovasküler tıpta terapötik ve kardiyotoksik ilaç etkileri için bu taramayı kolaylaştıracaktır. Başlamak için, yetiştirme odalarını ve grafit elektrotlarını% 10'luk bir izopropanol çözeltisinin bir litresine batırın ve gece boyunca çalkalayın.
Ertesi gün, odaları 3 dakika boyunca% 100 izopropanol çözeltisine aktarın, ardından odaların ve grafit elektrotların laminer bir akış başlığı altında hava ile kurumasına izin verin. Rocker üzerindeki mevcut konumlara göre her odaya bir devre kartı takın. Üreticinin talimatlarına göre devre kartına iki grafit elektrot yerleştirin, ardından enfeksiyonu önlemek için odaya 35 milimetrelik bir Petri kabı kapağı yerleştirin.
Ardından, kesme tepsisini% 90 ila% 95'e kadar dilimleme tamponu ile doldurun. Doku örneğini soğuk dilimleme tamponuyla doldurulmuş 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve çanağı 4 santigrat derecede bir soğutma plakasına yerleştirin. Endokardın cımbızla tutularak endokardiyal trabekülleri çıkarın, ardından yaklaşık 3 milimetre endokardiyal dokuyu kesmek için makas kullanın.
Kesilmiş doku numunesini, endokardiyal tarafı, kare konumda sabitlenmiş dört adet 0,9 x 70 milimetre 20 gauge iğne kullanarak 2 x 2 santimetrelik bir kauçuk yamaya kadar sabitleyin. Her iğne ucunun çapraz kenarının içe doğru baktığından, fiksasyonu arttırdığından ve miyokardın zarar görmesini önlediğinden emin olun. Bir neşter kullanarak, dört iğne karesinin dışındaki tüm fazla dokuyu kesin.
Cımbız kullanarak, fazla dilimleme tamponunu çıkarmak için kesilmiş numuneyi 10 saniye boyunca steril bir doku parçasına yerleştirin. Daha sonra, agaroz şırıngasını su banyosundan çıkarın ve numuneyi agaroza batırın. Agarozun bir soğutma plakasında beş dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
Numunenin endokardiyal tarafı agarozda görünür olmalıdır. Cımbız kullanarak, agarozda bulunan numunenin epikardiyal tarafını yapıştırılmış alanın üzerine yerleştirin, ardından agaroz içeren numuneyi, agarozu kesmeden veya zarar vermeden künt bir aletle üstten hafifçe bastırın. Tutkalın 1 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
Titreşim genliğini 1 milimetreye, ilk kesme hızını saniyede 0,07 milimetreye ve dilimin kalınlığını 300 mikrona ayarlayın. Yetiştirme sistemini bir bilgisayara bağladıktan sonra, ilgili yazılım programını başlatın. Rocker hızını 60 rpm'ye ayarlayın ve stimülasyon parametrelerini önceden ayarlayın.
İnsan kalp dilimleri için, standart stimülasyonu 50 miliamper veya akımla bifazik impulslara ayarlayın 3 milisaniye pozitif akım, 1 milisaniye duraklama ve dakikada 30 atım veya bpm hızında 3 milisaniyelik ters akım darbesinden oluşan bir akım, ardından yazılımın elektrot göstergelerini kontrol edin ve yetiştirme odalarının elektrotlarının doğru çalıştığını doğrulayın. Cımbız kullanarak, agarozu dokudan ayırın. Dokuya dokunmaktan kaçının ve dokuya verilen herhangi bir hasar yetiştiriciliğin başarı oranını azaltacağından dikkatlice kullanın.
Bir numuneye iki plastik üçgen takmak için, steril bir Petri kabı kapağına 1 mikrolitre yapıştırıcı yerleştirin. Otoklavlanmış bir plastik üçgeni almak için kancalı bir cımbız kullanın. Üçgenin ön kenarını hızlı bir şekilde yapıştırıcıya batırın ve üçgeni kardiyomiyosit hizalamasına dik olarak numuneye yapıştırın.
Diğer üçgen için bu işlemi tekrarlayın. Bir neşter kullanarak, üçgen genişliğini aşan dokuyu kesin ve iki monte edilmiş üçgenle dilimi, dilimleme tamponu içeren kesme tepsisine geri yerleştirin. Orta dolgulu ekim odasını inkübatörden çıkarın.
Hazırlanmış bir dilim seçin ve her pime bir üçgen bağlayarak hazneye yerleştirin. Montaj pimleri arasındaki mesafeyi numune boyutuna göre ayarlayın. Numunenin ortama batırıldığından emin olun.
Çanağı rocker'a yerleştirdikten sonra, bilgisayar ekranındaki ilgili grafiğin taban çizgisi artık değişmeyene kadar ayar vidasını saat yönünün tersine çevirerek ön yükü azaltın, ardından ayar vidasını saat yönünde çevirerek ön yükü veya gerilimi dikkatlice artırın. Yüksek sertliğe sahip odalar için, grafikteki karşılık gelen taban çizgisi bir milinewton ön yüke karşılık gelen 1.000 ila 1.200 birim artana kadar devam edin. Taze ekim ortamını hazırladıktan sonra, ortamı bir su banyosunda veya sıcak hava inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika önceden ısıtın.
Haznede yaklaşık 0,8 mililitre bırakarak ortamı odadan çıkarın, ardından aynı odaya 1,6 mililitre taze ortam ekleyin ve oda başına toplam orta ila 2,4 mililitre hacim yapın. Son olarak, odanın kapağını geri yerleştirin ve yetiştirme odasını kendi konumuna yerleştirin. Tipik bir stimülasyon sırasında beş miyokard diliminin kasılmasının okunması, duraklama sonrası potansiyel, stimülasyon eşiği, kuvvet-frekans ilişkisi ve refrakter periyodun dört ayrı bölümünden oluşuyordu.
Kontrol ile karşılaştırıldığında, kalsiyum antagonistleri, nifedipin ve kalsiseptin ile muamele edilen dilimlerin kasılma kuvveti 10 dakika içinde azaltıldı. Buna karşılık, voltaj kapılı kalsiyum kanal agonisti Bay-K8644, büzülme kuvvetini arttırdı. Kontrol ve tedavi edilen dilimlerin duraklama sonrası potansiyeli, sarkoplazmik retikulumdan hücre içi kalsiyum salınımı açısından değerlendirildi.
Denetim dilimi herhangi bir değişiklik göstermedi. Kalsiseptin ve nifedipin varlığında, L-tipi kalsiyum kanallarının inhibisyonu 50 saniyelik bir duraklamadan sonra ilk kasılmanın güçlendirilmesine yol açmıştır ve hücre içi kalsiyum salınımının toplam kontraktiliteye daha yüksek bir göreceli katkısını yansıtmaktadır. Ters etki, hücre dışı kalsiyumun L-tipi kalsiyum kanallarından girişini uyaran Bay-K8644 ile gözlenmiştir.
Kuvvet-frekans ilişkisi analizinde kontrol diliminde herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Kalsiseptin tedavisi, tedavi öncesi ve sonrası verileri karşılaştırırken stimülasyon sıklığının artması üzerine dilimin uyaranları takip etme yeteneğini değiştirmedi. Kalsiseptin ile karşılaştırıldığında, nifedipin daha yüksek tempolu oranlarda kontraktilitede bir artışı önledi ve maksimum yakalama oranını 80 bpm'de düşürdü.
Bay-K8644 ile çok düşük stimülasyon frekanslarında artan büzülme kuvveti gözlendi. Bununla birlikte, 50 bpm'den daha yüksek frekanslarda, kasılma kuvveti ön işlem durumundan daha düşüktü. Eksize edilen doku hızlı bir şekilde 4 derece kardiyoplejiye aktarılmalıdır.
Dilimlemeden sonra, plastik üçgenler lif yönüne dik olarak tutturulmalıdır. Ön yük 1500 milinewtonu geçmemelidir. Biyomimetik dilim kültürü, araştırmacıların yetişkin insan miyokardında rejenerasyon ve onarımı incelemek için genetik manipülasyonların yanı sıra hücre bazlı terapileri kullanmalarına yardımcı olabilir.
