Questo protocollo delinea un metodo non invasivo per indurre mal di schiena cronico nei topi per un massimo di 10 settimane, che può essere eseguito in modo rapido e affidabile con un allenamento minimo. L'aspetto più difficile di questa tecnica è riconoscere come ci si sente a iniettare il legamento rispetto all'iniezione di muscoli. La sensazione di resistenza al contatto indica l'iniezione del legamento.
L'assenza di resistenza significa che l'ago potrebbe trovarsi nel muscolo o nella cavità addominale. Per iniziare, prendi una superficie piana sterile per posizionare il mouse. Quindi, posizionare una stazione di recupero del termoforo accanto alla configurazione dell'ambulatorio per trasferire immediatamente i topi dopo l'iniezione.
Quindi, preparare l'urochinasi e una siringa di Hamilton. Prelevare la soluzione in anticipo per ridurre al minimo il tempo che il topo trascorre sotto anestesia. Dopo aver anestetizzato il topo, utilizzare due dita per localizzare i segmenti spinali lombari in L2 e L3 sotto la gabbia toracica e verificare il sito di iniezione.
Posizionare la punta della siringa Hamilton vicino al dorso. Posizionare la siringa con un angolo di circa 45 gradi nel legamento immediatamente adiacente all'osso. Inserire la punta dell'ago delicatamente, ma con fermezza, nel legamento e iniettare lentamente fino a quando tutti e cinque i microlitri sono stati iniettati.
Rimuovere l'ago delicatamente e lentamente. Quindi, posizionare il mouse nella stazione di recupero del calore fino a quando non si riattiva e diventa mobile. Controllare i topi per un'ora dopo l'intervento chirurgico per assicurarsi che tutte le normali funzioni motorie continuino.
Dopo l'intervento chirurgico, controllare il peso e il sito di iniezione dei topi ogni giorno per una settimana per prevenire eventuali infezioni o complicazioni. Prima del test, spostare ogni animale in un cubicolo separato sul tavolo di prova con un piano di prova. Quindi, stimola il cuscinetto del piede con il filamento Von Frey 3.61 che suscita quattro grammi di forza.
Un ritiro del piede da tre a cinque stimoli è considerato una risposta positiva. Ora, applica il filamento successivo più debole della serie fino a quando l'animale non smette di rispondere alla stimolazione meccanica. Usa il filamento più alto fino a quando non viene suscitata una risposta, quindi torna al filamento inferiore.
Utilizzando un algoritmo di adattamento della curva, calcola la soglia di ritiro meccanico, che è la quantità minima di forza necessaria per ottenere una risposta il 50% delle volte. Per eseguire il test di Hargreaves, posizionare i topi in cubicoli su una superficie di vetro riscaldata dal basso da un emettitore a infrarossi. Misura il tempo che intercorre tra l'applicazione di uno stimolo di luce infrarossa sulla zampa posteriore del topo e il ritiro come latenza del piede.
Per il test della piastra fredda, posizionare i topi sull'apparecchio della piastra fredda raffreddato a meno nove gradi Celsius. Registrare il tempo impiegato dal mouse per sollevare il piede dopo essere stato posizionato sull'apparecchio come latenza per ritirare il piede. Per eseguire il test dell'ansia, posizionare ogni animale nella scatola del test di preferenza del luogo con un passaggio tra due camere.
Una camera dell'apparecchio dovrebbe essere molto illuminata, mentre il lato opposto dovrebbe rimanere buio. Utilizzando un computer, monitora i tempi di occupazione e le transizioni di luce e buio dell'animale durante un test di 10 minuti. Successivamente, posiziona i roditori modello o gli animali ingenui sul labirinto zero o usa il test di preferenza del luogo chiaro o scuro a due camere.
Valuta il tempo trascorso nelle aree chiuse e aperte del labirinto utilizzando un cronometro. Per il test di depressione del saccarosio, spruzzare una soluzione di saccarosio dal 10 al 30% sul codice dorsale e valutare la frequenza, la durata e la latenza della toelettatura per 10 minuti. Per eseguire nuovi test sugli oggetti, acclimatare i topi individualmente a una gabbia di plastica trasparente con una parte superiore aperta per un'ora.
Aggiungi due mini figure giocattolo identiche agli angoli opposti della gabbia per cinque minuti. Acclimatare gli animali il giorno del test per un'ora e posizionare le due mini figure identiche nelle stesse posizioni della gabbia per cinque minuti prima di riportarle nella gabbia di casa. Quindi, sostituisci una delle figure originali con un oggetto nuovo nettamente diverso.
Dopo quattro ore, riporta i topi nella gabbia di prova e registra il tempo trascorso ad esplorare gli oggetti. Per la valutazione della funzione motoria, costruisci un tunnel da un tubo di carta assorbente tagliato longitudinalmente su un bordo. Stendere il tunnel aperto su un foglio di carta per stampante pulito.
Tieni i topi delicatamente finché non si calmano. Applica inchiostro di china non tossico sulle zampe di un topo mettendole in un calamaio, in un tampone per timbri o usando un batuffolo di cotone. Rilascia i topi all'ingresso del tunnel.
Lascia che corrano attraverso il tunnel e catturali alla fine. Segna le impronte delle zampe in base alla lunghezza del passo, alla larghezza del passo e all'estensione delle dita dei piedi. I test di ipersensibilità meccanica e termica hanno dimostrato che i topi con mal di schiena cronico avevano una sensibilità meccanica, al caldo e al freddo significativamente aumentata rispetto ai controlli naïve.
L'analisi dell'ansia ha mostrato che il tempo totale trascorso nella camera luminosa della scatola chiara e scura e il numero di eventi di allevamento erano significativamente più bassi nei topi con mal di schiena cronico, indicando ansia. Durante il Sucrose Splash Test, i topi con mal di schiena cronico hanno mostrato un tempo di toelettatura inferiore e il numero di toelettatura. Tuttavia, la quantità di tempo prima dell'inizio della toelettatura è stata significativamente aumentata.
La lunghezza del passo tra i topi con mal di schiena cronico e i topi ingenui era significativamente diversa. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è che si mira ai legamenti intorno alla colonna vertebrale, non al muscolo. Il modello del mal di schiena cronico fornisce uno strumento affidabile per valutare una varietà di nuove ricerche, farmacologiche e altre potenziali terapie.
