Este protocolo descreve um método não invasivo para induzir dor lombar crônica em camundongos por até 10 semanas, que pode ser realizado de forma rápida e confiável com treinamento mínimo. O aspecto mais difícil desta técnica é reconhecer como injetar ligamento se sente versus injetar músculo. Sentir resistência ao contato indica injeção ligamentar.
Sem resistência significa que a agulha pode estar no músculo ou na cavidade abdominal. Para começar, pegue uma superfície plana estéril para colocar o mouse. Em seguida, coloque uma estação de recuperação de almofada de aquecimento ao lado da configuração da cirurgia para transferir imediatamente os ratos após a injeção.
Em seguida, prepare a uroquinase e uma seringa de Hamilton. Desenhe a solução com antecedência para minimizar o tempo que o rato passa sob anestesia. Após anestesiar o camundongo, utilizar dois dedos para localizar os segmentos da coluna lombar em L2 e L3 abaixo da caixa torácica e verificar o local da injeção.
Coloque a ponta da seringa de Hamilton ao lado da coluna. Posicione a seringa em um ângulo de aproximadamente 45 graus no ligamento imediatamente adjacente ao osso. Insira a ponta da agulha suavemente, mas com firmeza, no ligamento e injete lentamente até que todos os cinco microlitros tenham sido injetados.
Retire a agulha suave e lentamente. Em seguida, coloque o mouse na estação de recuperação de calor até que ele acorde e se torne móvel. Verifique os ratos por uma hora após a cirurgia para garantir que toda a função motora normal continue.
Após a cirurgia, verifique o peso e o local de injeção dos ratos diariamente por uma semana para evitar qualquer infecção ou complicações. Antes de testar, mova cada animal para um cubículo transparente separado na mesa de teste com uma parte superior da tela. Em seguida, estimule o coxim pé com o filamento de Von Frey 3,61 que provoca quatro gramas de força.
A retirada dos pés de três a cinco estímulos é considerada uma resposta positiva. Agora, aplique o próximo filamento mais fraco da série até que o animal pare de responder ao estímulo mecânico. Use o filamento superior até que uma resposta seja obtida e, em seguida, volte para o filamento inferior.
Usando um algoritmo de ajuste de curva, calcule o limiar de retirada mecânica, que é a quantidade mínima de força necessária para provocar uma resposta em 50% do tempo. Para realizar o Teste de Hargreaves, coloque os ratos em cubículos em uma superfície de vidro aquecida por baixo por um emissor infravermelho. Meça o tempo desde a aplicação do estímulo de luz infravermelha na pata traseira do rato até a retirada como latência do pé.
Para o Teste da Placa Fria, coloque os ratos no aparelho de placa fria resfriado a menos nove graus Celsius. Registre o tempo que o mouse leva para levantar o pé após ser colocado no aparelho como a latência para retirar o pé. Para realizar o Teste de Ansiedade, posicione cada animal na caixa de teste de preferência de local com uma passagem entre duas câmaras.
Uma câmara do aparelho deve estar iluminada com clareza, enquanto o lado oposto deve permanecer escuro. Usando um computador, monitore os tempos de ocupação e transições claros e escuros do animal durante um teste de 10 minutos. Em seguida, coloque os roedores modelo ou animais ingênuos no labirinto zero, ou use o teste de preferência de lugar claro ou escuro de duas câmaras.
Avalie o tempo gasto em áreas fechadas e abertas do labirinto usando um cronômetro. Para o Sucarose Splash Depression Test, borrife uma solução de sacarose a 10 a 30% no código dorsal e pontue a frequência, duração e latência da tosa por 10 minutos. Para realizar novos testes com objetos, aclimate camundongos individualmente a uma gaiola de plástico transparente com uma tampa aberta por uma hora.
Adicione duas mini figuras de brinquedo idênticas em cantos opostos da gaiola por cinco minutos. Aclimatar os animais no dia do teste por uma hora e colocar as duas mini figuras idênticas nas mesmas posições da gaiola por cinco minutos antes de devolvê-los à gaiola de origem. Em seguida, substitua uma das figuras originais por um objeto novo distintamente diferente.
Após quatro horas, devolva os ratos à gaiola de teste e registre o tempo gasto explorando os objetos. Para avaliação da função motora, construa um túnel a partir de um tubo de papel toalha cortado longitudinalmente em uma borda. Espalhe o túnel em um pedaço limpo de papel de impressora.
Segure os ratos suavemente até que estejam calmos. Aplique tinta indiana não tóxica nas patas de um rato, colocando-as em um poço de tinta, bloco de carimbo ou usando um cotonete. Solte os ratos na entrada do túnel.
Permita que eles corram pelo túnel e os capturem no final. Marcar impressões de patas com base no comprimento da passada, largura da passada e espalhamento dos dedos. Ensaios de hipersensibilidade mecânica e térmica demonstraram que os camundongos com dor lombar crônica tiveram sensibilidade mecânica, ao calor e ao frio significativamente aumentada em comparação com os controles virgens.
A análise de ansiedade mostrou que o tempo total gasto na câmara de luz da caixa clara e escura e o número de eventos de criação foram significativamente menores em camundongos com dor crônica nas costas, indicando ansiedade. Durante o Sucarose Splash Test, camundongos com dor lombar crônica apresentaram menor tempo de tosa e o número de tosas. No entanto, o tempo para o início da tosa aumentou significativamente.
O comprimento da passada entre camundongos com dor lombar crônica e camundongos virgens foi significativamente diferente. A coisa mais importante a lembrar ao tentar este procedimento é que você está visando os ligamentos ao redor da coluna, não o músculo. O modelo de dor lombar crônica fornece uma ferramenta confiável para avaliar uma variedade de novas pesquisas, farmacológicas e outras potenciais terapêuticas.
