Muchos informes que evalúan el sistema biliar extrahepático informaron que obtuvieron las muestras, pero no cómo las obtuvieron, lo que plantea problemas con respecto a la comparabilidad. La principal ventaja de esta técnica es que todo el sistema biliar extrahepático se puede diseccionar y las células contaminantes se pueden eliminar de forma atraumática. Nuestro protocolo de disección se puede aplicar generalmente a enfoques experimentales que trabajan en trastornos murinos del conducto biliar neonatal, con el objetivo de la disección del sistema biliar extrahepático.
Algunas características del protocolo, por ejemplo, dejar el estómago unido al duodeno, podrían ser útiles en la investigación de la atresia duodenal para permitir la orientación correcta de la leche parcialmente digerida extraída por el estómago. Al principio, la técnica puede requerir algún tiempo para el entrenamiento. Practicar y seguir el enfoque paso a paso aumentará la velocidad y el resultado.
Para comenzar, coloque los instrumentos desinfectados y esterilizados en autoclave sobre una superficie estéril junto a la mesa de operaciones. Después de hacer un corte en el peritoneo, expanda el corte hasta la ubicación de la decapitación, siguiendo la línea axilar frontal izquierda. Retire la piel del lado izquierdo al derecho con fórceps atraumáticos.
Bajo un microscopio, sostenga el peritoneo que rodea el bazo. Levántelo suavemente hasta que el peritoneo se asemeje a una estructura similar a una tienda de campaña, y corte un agujero de un milímetro en el centro. Espere a que la tienda peritoneal se llene de aire.
Corte el peritoneo en una ventana enmarcada por las costillas inferiores, ambas regiones abdominales laterales y el área inferior de la vejiga. Asegure el acceso completo al hígado, al sistema de conductos biliares, al estómago, al intestino delgado y al colon. Examine la vesícula biliar y los conductos biliares tirando cuidadosamente del proceso xifoide en una posición ventral craneal.
Evite el desgarro del ligamento falciforme que puede conducir al desgarro de la vesícula biliar del sistema de conductos biliares. Luego, libere el tirón del proceso xifoide. Tire suavemente hacia abajo del duodeno para liberar el sistema de conductos biliares.
Luego, realice la movilización en bloque inferior identificando la papila duodenal, que conecta el sistema de conductos biliares con el duodeno. Corte a través del duodeno unos dos centímetros hacia el lado lateral derecho de la papila. Luego, corte a través del área pilórica.
Asegúrese de que el contenido del estómago esté presente en el área pilórica entre el lugar de corte y la papila duodenal. Para realizar la movilización en bloque superior, tire suavemente del proceso xifoide y obtenga acceso al ligamento falciforme. Haga un corte de un centímetro a través del ligamento falciforme entre la vesícula biliar y cerca del proceso xifoideo.
Corte a través de las estructuras de conexión entre el hígado y el tórax, como el esófago, la vena cava inferior, la aorta torácica y todos los ligamentos que rodean el área desnuda del hígado. Además, corte todas las conexiones de tejido dorsalmente restantes. Con un aumento microscópico inferior a 20 veces, coloque la muestra en bloque en una almohadilla de espuma.
Ensamblar la muestra reorganizándola en la posición anatómica correcta. Usando un movimiento suave, aplanar la parte oral y aboral del duodeno. Usando fórceps atraumáticos, comience el movimiento de aplanamiento en la papila duodenal y continúe hasta los bordes cortantes.
Luego, alise el contenido pulposo blanco del estómago en la parte oral del duodeno. Identificar la parte oral y aboral del duodeno para descartar una probable rotación del conducto biliar. Corte los restos grandes de tejido hepático antes de diseccionar el conducto biliar.
Después de algunos movimientos de raspado, transfiera la muestra a una posición más limpia en la estera de espuma. Utilice el tejido hepático menos comprimido en segundo plano para optimizar la vista para la diferenciación entre EBDS y células no deseadas. Procesar el ligamento hepatoduodenal hasta que quede el EBDS aislado.
Observe la arteria hepática y la vena porta que surgen como filamento blanco y muy delicado, aproximadamente de tres a cinco milímetros por vía oral fuera de la papila duodenal. Con cuidado, retire este delicado filamento con un suave tirón hacia el lado lateral izquierdo. Asegúrese de que los movimientos de raspado comiencen desde el sistema de conductos biliares y conduzcan a los límites del hígado.
Usando este protocolo, EBDS se diseccionó de neonatos murinos de nueve días de edad. La longitud del EBDS aislado desde la vesícula biliar hasta la papila duodenal fue inferior a 10 milímetros, y el diámetro del delicado conducto colédoco varió de 0,05 a 0,2 milímetros. La tinción con hematoxilina eosina se realizó en la sección longitudinal de la EBDS con una luz abierta.
Los colangiocitos se identificaron alrededor de la luz como una monocapa y se tiñeron más oscuros. Los investigadores deben compartir y estandarizar técnicas operativas como los protocolos de disección e inyección para mejorar la comparabilidad y la rápida usabilidad de sus estudios y resultados. La disección anterior será ventajosa para los enfoques histológicos y unicelulares, como el aislamiento de intra y extraperi-colangiocitos, ya que resulta en la reducción de la contaminación del cultivo celular.
