Во многих докладах, оценивающих внепеченочную желчную систему, сообщалось, что они получили образцы, но не то, как они их получили, что поднимает вопросы относительно сопоставимости. Основным преимуществом этой методики является то, что вся внепеченочная билиарная система может быть рассечена, а загрязняющие клетки могут быть удалены атравматично. Наш протокол рассечения может быть в целом применен к экспериментальным подходам, работающим с нарушениями мочевых неонатальных желчных протоков, направленных на рассечение внепеченочной желчной системы.
Некоторые особенности протокола, например, оставление желудка прикрепленным к двенадцатиперстной кишке, могут быть полезны при исследовании атрезии двенадцатиперстной кишки, чтобы обеспечить правильную ориентацию частично переваренного молока, сцеженного желудком. В начале техника может потребовать некоторого времени для обучения. Практика и следование поэтапному подходу увеличит скорость и результат.
Для начала поместите продезинфицированные и автоклавные инструменты на стерильную поверхность рядом с операционным столом. Сделав разрез в брюшине, разверните разрез до места обезглавливания, следуя левой фронтальной подмышечной линии. Снимите кожу слева на правую сторону атравматическими щипцами.
Под микроскопом подержите брюшину, окружающую селезенку. Осторожно поднимите его вверх, пока брюшина не станет напоминать палатку, и вырежьте одномиллиметровое отверстие в центре. Подождите, пока перитонеальная палатка наполнится воздухом.
Отрежьте брюшину в окне, обрамленном нижними ребрами, как боковыми областями живота, так и нижней областью мочевого пузыря. Обеспечьте полный доступ к печени, системе желчных протоков, желудку, тонкому кишечнику и толстой кишке. Осмотрите желчный пузырь и желчные протоки, осторожно вытянув мечевидный отросток в черепно-вентральное положение.
Избегайте разрыва фальциформной связки, что может привести к разрыву желчного пузыря из системы желчных протоков. Затем отпустите притяжение мечевидного отростка. Осторожно потяните вниз двенадцатиперстную кишку, чтобы освободить систему желчных протоков.
Затем выполняют нижнюю en-блоковую мобилизацию, идентифицируя дуоденальный сосочек, который соединяет систему желчных протоков с двенадцатиперстной кишкой. Прорежьте двенадцатиперстную кишку примерно на два сантиметра к правой боковой стороне сосочка. Затем прорежьте пилорическую область.
Убедитесь, что содержимое желудка присутствует в пилорической области между местом разреза и дуоденальным сососком. Для выполнения мобилизации верхнего Эн-блока осторожно вытяните мечевидный отросток и получите доступ к фальциформной связке. Сделайте сантиметровый разрез через фальциформную связку между желчным пузырем и близким к мечевидному отростку.
Прорежьте соединительные структуры между печенью и грудной клеткой, такие как пищевод, нижняя полая вена, грудная аорта и все связки, которые окружают голую область печени. Кроме того, разрежьте все дорсально-оставшиеся тканевые соединения. При 20-кратном микроскопическом увеличении поместите образец En-bloc на пенопластовую прокладку.
Соберите образец, реорганизовав его в правильном анатомическом положении. Легкими движениями уплощают ротовую и аборальную часть двенадцатиперстной кишки. С помощью атравматических щипцов начинают уплощение на дуоденальном сосочке и продолжают до режущих кромок.
Затем разгладьте белое содержимое пульпы желудка в ротовой части двенадцатиперстной кишки. Определите оральную и аборальную часть двенадцатиперстной кишки, чтобы исключить вероятное вращение желчных протоков. Отрежьте крупные остатки печеночной ткани перед рассечением желчного протока.
После нескольких соскобовых движений переместите образец в более чистое положение на пенопластовом коврике. Используйте менее сжатую ткань печени на заднем плане, чтобы оптимизировать вид для дифференцировки между EBDS и нежелательными клетками. Обрабатывайте гепатодуоденальную связку до тех пор, пока не останется изолированная EBDS.
Наблюдайте за печеночной артерией и воротной веной, возникающими в виде белой и очень нежной нити, примерно в трех-пяти миллиметрах перорально от двенадцатиперстной кишки. Осторожно удалите эту нежную нить, осторожно потянув на левую боковую сторону. Убедитесь, что движения соскоба начинаются с системы желчных протоков и приводят к границам печени.
Используя этот протокол, EBDS был вскрыт из девятидневных новорожденных мышей. Длина выделенного ЭБДС от желчного пузыря до дуоденального сосочка составляла менее 10 миллиметров, а диаметр нежного холедоха тонкого протока варьировался от 0,05 до 0,2 миллиметра. Окрашивание гематоксилином эозина проводили на продольном сечении EBDS с открытым просветом.
Холангиоциты были идентифицированы вокруг просвета как монослой и окрашены в более темный цвет. Исследователи должны делиться и стандартизировать операционные методы, такие как протоколы вскрытия и инъекций, чтобы улучшить сопоставимость и быстрое использование своих исследований и результатов. Предшествующее рассечение будет выгодно для гистологических и одноклеточных подходов, таких как выделение интра- и экстраперихололангиоцитов, поскольку это приводит к снижению загрязнения клеточной культуры.
