Molti rapporti che valutano il sistema biliare extraepatico hanno riferito di aver ottenuto i campioni ma non come li hanno ottenuti, sollevando problemi di comparabilità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'intero sistema biliare extraepatico può essere sezionato e le cellule contaminanti possono essere rimosse in modo atraumatico. Il nostro protocollo di dissezione può essere generalmente applicato ad approcci sperimentali che lavorano su disturbi murini del dotto biliare neonatale, mirando alla dissezione del sistema biliare extraepatico.
Alcune caratteristiche del protocollo, ad esempio, lasciando lo stomaco attaccato al duodeno, potrebbero essere utili nella ricerca dell'atresia duodenale per consentire un corretto orientamento da parte del latte parzialmente digerito espresso dallo stomaco. All'inizio, la tecnica potrebbe richiedere un po 'di tempo per l'allenamento. Praticare e seguire l'approccio passo-passo aumenterà la velocità e il risultato.
Per iniziare, posizionare gli strumenti disinfettati e autoclavati su una superficie sterile accanto al tavolo operatorio. Dopo aver effettuato un taglio nel peritoneo, espandere il taglio nella posizione della decapitazione, seguendo la linea ascellare frontale sinistra. Rimuovere la pelle dal lato sinistro a quello destro con una pinza atraumatica.
Al microscopio, tenere il peritoneo che circonda la milza. Sollevalo delicatamente fino a quando il peritoneo assomiglia a una struttura simile a una tenda e taglia un buco di un millimetro al centro. Aspetta che la tenda peritoneale sia piena d'aria.
Tagliare il peritoneo in una finestra incorniciata dalle costole inferiori, entrambe le regioni addominali laterali e l'area della vescica inferiore. Garantire il pieno accesso al fegato, al sistema dei dotti biliari, allo stomaco, all'intestino tenue e al colon. Esaminare la cistifellea e i dotti biliari tirando attentamente il processo xifoideo in posizione ventrale cranica.
Evitare la lacerazione del legamento falciforme che può portare alla lacerazione della cistifellea dal sistema del dotto biliare. Quindi, rilasciare l'attrazione del processo xifoideo. Tirare delicatamente verso il basso il duodeno per liberare il sistema del dotto biliare.
Quindi, eseguire la mobilizzazione inferiore in blocco identificando la papilla duodenale, che collega il sistema del dotto biliare al duodeno. Tagliare il duodeno di circa due centimetri sul lato laterale destro della papilla. Quindi, tagliare attraverso l'area pilorica.
Assicurarsi che il contenuto dello stomaco sia presente nell'area pilorica tra la posizione di taglio e la papilla duodenale. Per eseguire la mobilizzazione superiore in blocco, tirare delicatamente il processo xifoideo e accedere al legamento falciforme. Fai un taglio di un centimetro attraverso il legamento falciforme tra la cistifellea e vicino al processo xifoideo.
Tagliare le strutture di collegamento tra il fegato e il torace, come l'esofago, la vena cava inferiore, l'aorta toracica e tutti i legamenti che circondano l'area nuda del fegato. Inoltre, tagliare tutte le connessioni tissutali rimanenti dorsalmente. Con un ingrandimento microscopico inferiore a 20 volte, posizionare il campione in blocco su un tampone di schiuma.
Assemblare il campione riorganizzandolo nella corretta posizione anatomica. Usando un movimento delicato, appiattire la parte orale e aborale del duodeno. Utilizzando una pinza atraumatica, iniziare il movimento di appiattimento sulla papilla duodenale e continuare fino ai bordi taglienti.
Quindi, levigare il contenuto polposo bianco dello stomaco nella parte orale del duodeno. Identificare la parte orale e quella aborale del duodeno per escludere la probabile rotazione del dotto biliare. Tagliare via grandi resti di tessuto epatico prima di sezionare il dotto biliare.
Dopo alcuni movimenti raschianti, trasferire il campione in una posizione più pulita sul tappetino di schiuma. Utilizzare il tessuto epatico meno schiacciato sullo sfondo per ottimizzare la visualizzazione per la differenziazione tra EBDS e cellule indesiderate. Elaborare il legamento epatoduodenale fino a quando rimane l'EBDS isolato.
Osservare l'arteria epatica e la vena porta che si presentano come filamenti bianchi e molto delicati, a circa tre o cinque millimetri per via orale dalla papilla duodenale. Con attenzione, rimuovere questo filamento delicato con una leggera trazione sul lato laterale sinistro. Assicurarsi che i movimenti di raschiatura inizino dal sistema del dotto biliare e portino ai confini del fegato.
Utilizzando questo protocollo, EBDS è stato sezionato da neonati murini di nove giorni. La lunghezza dell'EBDS isolato dalla cistifellea alla papilla duodenale era inferiore a 10 millimetri e il diametro del delicato dotto coledoco variava da 0,05 a 0,2 millimetri. La colorazione dell'eosina ematossilina è stata eseguita sulla sezione longitudinale dell'EBDS con un lume aperto.
I colangiociti sono stati identificati che circondano il lume come un monostrato e sono stati tinti più scuri. I ricercatori dovrebbero condividere e standardizzare le tecniche operative come i protocolli di dissezione e iniezione per migliorare la comparabilità e la rapida fruibilità dei loro studi e risultati. La dissezione precedente sarà vantaggiosa per approcci istologici e monocellulari, come l'isolamento di intra ed extraperi-colangiociti, perché si traduce nella riduzione della contaminazione della coltura cellulare.
