Muitos relatórios que avaliaram o sistema biliar extra-hepático relataram que obtiveram as amostras, mas não como as obtiveram, levantando questões relativas à comparabilidade. A principal vantagem desta técnica é que todo o sistema biliar extra-hepático pode ser dissecado e as células contaminantes podem ser removidas atraumaticamente. Nosso protocolo de dissecção pode ser geralmente aplicado a abordagens experimentais que trabalham com distúrbios do ducto biliar neonatal murino, visando a dissecção do sistema biliar extra-hepático.
Algumas características do protocolo, por exemplo, deixar o estômago preso ao duodeno, podem ser úteis na pesquisa da atresia duodenal para permitir a orientação correta pelo leite parcialmente digerido expresso pelo estômago. No início, a técnica pode exigir algum tempo para o treinamento. Praticar e seguir a abordagem passo-a-passo aumentará a velocidade e o resultado.
Para começar, coloque os instrumentos desinfetados e autoclavados em uma superfície estéril ao lado da mesa de operação. Depois de fazer um corte no peritônio, expanda o corte para o local da decapitação, seguindo a linha axilar frontal esquerda. Remova a pele do lado esquerdo para o direito com pinça atraumática.
Sob um microscópio, segure o peritônio ao redor do baço. Leve-o suavemente até que o peritônio se assemelhe a uma estrutura semelhante a uma tenda e corte um buraco de um milímetro no centro. Espere que a tenda peritoneal seja preenchida com ar.
Corte o peritônio em uma janela emoldurada pelas costelas inferiores, ambas as regiões abdominais laterais e a área inferior da bexiga. Garantir o acesso total ao fígado, sistema de ductos biliares, estômago, intestino delgado e cólon. Examine a vesícula biliar e os ductos biliares puxando cuidadosamente o processo xifoide em uma posição ventral craniana.
Evite rasgar o ligamento falciforme que pode levar ao rompimento da vesícula biliar do sistema do ducto biliar. Em seguida, libere a tração do processo xifoide. Puxe suavemente o duodeno para baixo para liberar o sistema de ducto biliar.
Em seguida, realize a mobilização En-bloc inferior, identificando a papila duodenal, que conecta o sistema de ducto biliar ao duodeno. Corte o duodeno cerca de dois centímetros para o lado lateral direito da papila. Em seguida, corte a área pilórica.
Certifique-se de que o conteúdo do estômago esteja presente na área pilórica entre o local de corte e a papila duodenal. Para realizar a mobilização En-bloc superior, puxe suavemente o processo xifoide e obtenha acesso ao ligamento falciforme. Faça um corte de um centímetro através do ligamento falciforme entre a vesícula biliar e perto do processo xifoide.
Corte as estruturas de conexão entre o fígado e o tórax, como o esôfago, a veia cava inferior, a aorta torácica e todos os ligamentos que cercam a área nua do fígado. Além disso, corte todas as conexões de tecido dorsalmente remanescentes. Sob ampliação microscópica de 20 vezes, coloque a amostra En-bloc em uma almofada de espuma.
Monte a amostra reorganizando-a na posição anatômica correta. Usando movimentos suaves, achate a parte oral e aboral do duodeno. Usando pinça atraumática, inicie o movimento de achatamento na papila duodenal e continue até as arestas de corte.
Em seguida, alise o conteúdo polpudo branco do estômago na parte oral do duodeno. Identifique a parte oral e a parte aboral do duodeno para descartar a provável rotação do ducto biliar. Corte grandes restos de tecido hepático antes de dissecar o ducto biliar.
Após alguns movimentos de raspagem, transfira a amostra para uma posição mais limpa no tapete de espuma. Use o tecido hepático menos espremido no fundo para otimizar a visão para diferenciação entre EBDS e células indesejadas. Processe o ligamento hepatoduodenal até que a EBDS isolada permaneça.
Observe a artéria hepática e a veia porta surgindo como filamentos brancos e muito delicados, a aproximadamente três a cinco milímetros por via oral da papila duodenal. Cuidadosamente, remova este filamento delicado usando uma puxada suave para o lado lateral esquerdo. Certifique-se de que os movimentos de raspagem começam a partir do sistema de ductos biliares e levam aos limites do fígado.
Utilizando este protocolo, a EBDS foi dissecada a partir de neonatos murinos de nove dias de idade. O comprimento da EBDS isolada da vesícula biliar à papila duodenal foi inferior a 10 milímetros, e o diâmetro do delicado ducto colédoco variou de 0,05 a 0,2 milímetros. A coloração com hematoxilina eosina foi realizada no corte longitudinal da EBDS com lúmen aberto.
Os colangiócitos foram identificados ao redor do lúmen como uma monocamada e foram tingidos mais escuros. Os pesquisadores devem compartilhar e padronizar técnicas operacionais, como dissecção e protocolos de injeção, para melhorar a comparabilidade e a rápida usabilidade de seus estudos e resultados. A dissecção prévia será vantajosa para abordagens histológicas e unicelulares, como o isolamento de intra e extrapericolangiócitos, pois resulta na redução da contaminação por cultura celular.
