El protocolo permite la estimación mutacional en microbios. Puede demostrar cómo un contexto ambiental de los organismos afecta la probabilidad de mutación espontánea. La principal ventaja de este protocolo es que es barato y eficiente.
Muchas estimaciones de la tasa de mutación se pueden hacer en paralelo. Las mutaciones que estas medidas de protocolo podrían seguir a la resistencia a los antibióticos. Así que este protocolo se puede utilizar para estudiar uno de los mayores desafíos del mundo, la resistencia a los antimicrobianos.
Este método puede proporcionar información sobre cómo el contexto ecológico de las células puede afectar la evolución de la resistencia a los antimicrobianos. Este protocolo estima las tasas mutacionales en el monocultivo de la cepa de laboratorio, pero la hemos aplicado a cepas clínicas y co-cultivo de dos cepas para distinguir la molécula bioneutral. Las reacciones más peligrosas utilizadas en este protocolo son la rifampicina antibiótica y el metanol.
Así que asegúrese de usar guantes y gafas protectoras cuando la rifampicina se disuelva en metanol. Para comenzar este procedimiento inocular tres ml de caldo líquido de lysogeny con un raspado de hielo de la población de glicerol E.coli K12. Agitar el cultivo lb a 120 rpm y a 37 grados centígrados durante aproximadamente siete horas.
Después de esto, diluir el cultivo 2000 veces con la solución salina. Añadir 10 ml de medio mínimo líquido Davis a cada tubo con cada uno que contenga una concentración diferente de glucosa como se muestra aquí. Añadir 100 microlitros del cultivo diluido a tres tubos de polímero inferior cónico de 50 ml.
Preparar 22 ml de cinco soluciones diferentes de medio mínimo Davis líquido con glucosa, cada una en su propio tubo de 50 ml como se describe en el protocolo de texto. Para preparar la inócula para los ambientes, primero mida la densidad óptica de los cultivos nocturnos a 600 nanómetros. Diluir los cultivos con solución salina y añadir entre 2200 y 110000 células a cada entorno.
Esto asegurará que el inóculo para un ml del entorno contenga entre 1000 y 5000 células. A continuación, cree un diseño aleatorio de cultivos paralelos para la placa de pozos profundos de 196. Transfiera un mL del medio inoculado a cada pozo de la placa de acuerdo con la disposición.
A continuación, fije la tapa de la placa con cinta adhesiva y pese toda la placa con la tapa y la cinta. Agitar la placa a 250 rpm y a 37 grados Centígrados durante 24 horas. Después de esto, coloque dos L de agua destilada en la incubadora para estabilizar la cantidad de evaporación entre los conjuntos experimentales.
Determinar el tamaño del inóculo mediante el enchapado de 10 microlitros de cada uno de los medios inoculados en una placa de agar TA no selectiva. Utilice un esparcidor estéril en forma de L hasta que la superficie del agar esté seca. A continuación, prepare el agar TA selectivo que contenga rifampicina en seis placas de pozo.
Pipetear cinco ml del agar TA selectivo en cada pozo de las seis placas de pozo. Contar las unidades formadoras de colonias en las placas de agar no selectivas, y determinar el tamaño de la inócula. Después de 24 horas de incubación, pesar toda la placa de pozo profundo para determinar la cantidad de evaporación, que es probable alrededor del 10%Transferir tres cultivos elegidos al azar por ensayo en tubos de microcentrífuga etiquetados.
Plato de los 81 cultivos paralelos restantes de la placa de pozo profundo en el agar TA selectivo que contiene rifampicina. A continuación, retire las tapas de las placas selectivas de agar y déjelas descubiertas en condiciones estériles para secar todo el líquido en la superficie del agar. Determinar el número de unidades formadoras de colonias diluyendo los cultivos de los tubos de microcentrífuga utilizando cinco pasos de dilución de 10 veces mezclando y vórtices 900 microlitros de solución salina con 100 microlitros del cultivo por etapa de dilución.
Placa 40 microlitros de la dilución final en el agar TA no selectivo y coloque la tapa en las placas. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Una vez que todos los pozos en una placa de seis pozos están libres del líquido de cultivo, coloque la tapa de nuevo en.
Luego incubar las placas con la tapa puesta a 37 grados Centígrados durante 44-48 horas. En el cuarto día, cuente las unidades formadoras de colonias en las placas de agar no selectivas. En el quinto día, cuente el número de colonias que son resistentes al antibiótico en las placas selectivas de agar TA.
Registrar la distribución entre las culturas paralelas del número observado de mutantes para un ensayo en particular. Abra el software adecuado en el equipo. En la pestaña de pruebas de hipótesis, deje los valores en sus valores predeterminados.
Haga clic en Examinar y seleccione el archivo de texto con la distribución de mutantes observados. Después de cargar el archivo, haga clic en la prueba realizada. En el lado derecho, bajo el resultado de la prueba, bajo la prueba de ML de una muestra, encontrar el número de mutación.
Este es m, el número esperado de eventos mutacionales. A continuación, estime la tasa de mutación de un genotipo particular en un entorno determinado como se describe en el protocolo de texto. Las tasas de mutación MG1655 de tres marcadores fenotípicos diferentes, cicloserina, rifampicina y ácido nalidixic se muestran aquí.
Las tasas de mutación se evalúan en un medio mínimo Davis con una concentración de glucosa de 80 mg/L, 125 mg/L y 250 mg/L. En un caso, se utiliza una concentración de glucosa de 1000 mg/L. Como era de esperar, las tasas de mutación son más altas para la resistencia a la cicloserina, la menor resistencia al ácido nalidixico y la tasa de resistencia a la rifampicina está en el medio.
El ensayo de fluctuación muestra claramente qué cepa es un mutador constitutivo y cuál tiene tasas de mutación normales. Como la cepa deletant mutT tenía una tasa de mutación a la resistencia al ácido nalidixic que es aproximadamente 50 veces mayor que la cepa MG1655 de control. Mientras preforma este protocolo, asegúrese de que sus células están creciendo bien.
Deben estar creciendo a densidad uniforme a través de cultivos paralelos con el mismo entorno. Un seguimiento de este procedimiento es determinar la secuencia de ADN del gen rpoB en colonias resistentes. Determinar cómo el espectro de mutaciones en la resistencia a la rifampicina varía con el genotipo microbiano ambiental.
Los ensayos de fluctuación en el siglo XX demostraron cómo la mutación es espontánea y aleatoria con respecto al medio ambiente. Ahora, están arrojando nueva luz sobre cómo las tasas de mutaciones varían con el medio ambiente genéticamente, ecológicamente, incluso socialmente.
