El establecimiento de un protocolo ChIP-seq en Aiptasia es el primer paso para investigar los puntos de referencia epigenéticos en los cnidarios simbióticos, y cómo estos pueden regular la interacción de un organismo con su entorno. El protocolo está optimizado para abordar las características desafiantes de los cnidarios, como la alta producción de moco y una alta proporción de agua a tejido, al aumentar el tiempo de reticulación y minimizar la pérdida de tejido. Recoge las anémonas en un tubo de 15 mililitros y deja que se asienten en el fondo del tubo.
Alternativamente, gírelos en una centrífuga a temperatura ambiente durante unos segundos, hasta 3.500 g. A continuación, retire el exceso de agua de mar con una bomba de vacío. Lave las anémonas suspendiéndolas en DPBS.
Y retire el DPBS después del lavado. Con unas pinzas o una espátula de plástico, transfiera las anémonas, sin el tampón superfluo, al tampón de reticulación al 0,5%. Incubarlos durante una hora en un rotador a una velocidad de 12 rotaciones por minuto y cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, retire el tampón de reticulación al 0,5% del tubo que contiene las anémonas. Rellene el tubo con el tampón de reticulación al 1%. E incubarlo en un rotador durante la noche a 12 rotaciones por minuto y cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, después de eliminar el tampón de reticulación del 1%, apague la reacción de reticulación suspendiendo las anémonas en el tampón de enfriamiento e incubando la suspensión en un rotador durante 20 minutos a 12 rotaciones por minuto y cuatro grados centígrados. A continuación, retire el tampón de enfriamiento y lave las anémonas dos veces en DPBS. Decantar el DPBS.
Y vacía las anémonas en un pañuelo de papel para eliminar la mayor cantidad de líquido posible. Vierta un poco de nitrógeno líquido en el mortero y transfiera las anémonas con unas pinzas. Con el mortero, comience rompiendo cuidadosamente el tejido.
Siga llenando con nitrógeno líquido, según sea necesario, para evitar la descongelación. Continúe moliendo hasta que la muestra se convierta en un polvo fino. Con una espátula, recoja la muestra y transfiérala al tampón de lisis, asegurándose de que la muestra se disuelva en el tampón.
Deje reposar la muestra en hielo durante un minuto antes de mezclarla por inversión. A continuación, después de lavar un molinillo de pañuelos con tampón de lisis, transfiera la muestra y la sumerja de 20 a 30 veces con un mortero apretado. Transfiera la muestra de nuevo al tubo.
E incubarlo durante la noche en un rotador a 14 rotaciones por minuto y cuatro grados centígrados. Coloque la muestra en el sonciador con la aguja a un centímetro por encima del fondo del tubo y sin tocar las paredes. Encienda el sonciador y asegúrese de que no se produzca espuma en la muestra.
Aumente lentamente la potencia de salida a dos y sonique durante dos minutos más. Después de eso, apague el sonciador, vuelva a poner la potencia de salida a cero y deje que la muestra descanse y se enfríe durante dos minutos. Dependiendo del volumen de la muestra y del número de inmunoprecipitaciones, o IPs, planificadas, aumente el volumen total de la muestra añadiendo Triton X-100 y 100X Protease Inhibitor Cocktail, o PIC, a concentraciones finales de 1% y 1X respectivamente.
Transfiera el volumen de cada IP a un tubo separado de 1,5 mililitros de baja retención para la inmunoprecipitación de cromatina, o ChIP, seguida de PCR cuantitativa o qPCR. Coloque el volumen equivalente de la muestra en otro tubo de 1,5 mililitros como un control simulado. Tome el 10% del volumen de las IP como control de entrada y guárdelo a menos 20 grados centígrados.
Agregue cuatro microgramos de trimetilación de histona 3 lisina 4, o trimetilación H3K4, a cada IP, pero no al simulacro. Incubar las reacciones IP y el simulacro en el rotador de tubos durante la noche a 12 rotaciones por minuto y cuatro grados centígrados. Corte la punta de una pipeta para aumentar su diámetro.
Y transfiera 50 microlitros de perlas magnéticas a tubos separados, un tubo por IP y uno para el simulacro. Agregue un mililitro de solución de bloqueo a cada tubo. E incubarlos en un rotador durante 30 minutos, como antes.
Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante de la solución de bloqueo y enjuague las perlas de la pared con el IP o la reacción simulada. Vuelva a colocar la mezcla en los respectivos tubos de baja retención que contienen las muestras. Incubar todos los tubos, como antes, durante tres horas.
Después de la incubación, coloque los IP y el simulacro en el estante magnético y espere unos 10 a 20 segundos para que los imanes se separen. Deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón de lavado con poca sal. Después de incubar los tubos, como antes, durante cinco minutos, vuelva a colocarlos en la rejilla magnética.
Retire el tampón de lavado con poca sal. Agregue un mililitro de tampón de lavado con alto contenido de sal e incube durante cinco minutos más. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta y lávese con un mililitro de tampón de sal TE.
Repita el lavado una vez más y enjuague las cuentas de la tapa del tubo. Después de desechar el segundo lavado con tampón de sal TE, agregue 210 microlitros de tampón de elución a cada reacción. Suspenda las perlas magnéticas y eluya a 65 grados centígrados, agitando a 700 rotaciones por minuto durante 15 minutos.
Coloque las reacciones en la rejilla magnética, recoja el eluyente y colóquelo en un tubo nuevo de 1,5 mililitros. A continuación, retire la entrada del congelador y agregue tampón de elución hasta un volumen total de 420 microlitros. Reticulación inversa de todos los eluyentes y la entrada incubándolos a 65 grados centígrados y 700 rotaciones por minuto durante la noche.
Para la digestión del ARN, agregue 10 microlitros de cóctel de ARNasa e incube a 42 grados centígrados y 700 rotaciones por minuto durante 30 minutos. Para la digestión de proteínas, agregue ocho microlitros de proteinasa K e incube a 55 grados centígrados y 700 rotaciones por minuto durante una hora. Bajo una campana extractora, agregue una muestra y el mismo volumen de mezcla de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico a cada tubo de gel de bloqueo de fase.
Agite los tubos vigorosamente y vérticelos brevemente, hasta que formen una capa blanca espumosa. Centrifugar durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y 20.000 g. Compruebe que la fase acuosa esté clara.
Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo con una pipeta. Agregue etanol al 100%, equivalente a dos veces el volumen de la muestra, y agite. Incube a menos 20 grados centígrados durante la noche, o a menos 80 grados centígrados durante 30 minutos.
Granular el ADN girando las muestras durante 30 minutos a 15.000 g. Con cuidado, decantar el sobrenadante y lavar los pellets con un mililitro de etanol al 70%. Gira a máxima velocidad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Decantar cuidadosamente antes de eliminar todo el etanol mediante pipeteo. Resuspender los pellets en 30 microlitros de agua libre de nucleasas. El ADN, asociado con la trimetilación de la histona 3 lisina 4, o H3K4, la trimetilación fue inmunoprecipitado, y las secciones de tejido de E. diaphana se tiñeron mediante tinción inmunofluorescente.
Los fragmentos de ADN obtenidos se analizaron por secuenciación y qPCR. El análisis basado en modelos de los datos de ChIP-seq identificó 19.107 picos. Como se esperaba para la trimetilación de H3K4, la mayoría de los picos se localizaron cerca del sitio de inicio transcripcional, o TSS, y la frecuencia del recuento de picos disminuyó drásticamente en ambos lados del TSS, especialmente hacia el cuerpo del gen.
Los cebadores de qPCR se diseñaron para dirigirse a varios loci cerca del SST respectivo de tres genes. Se observó un alto enriquecimiento de la trimetilación de H3K4 en relación con los controles de entrada y simulados. El porcentaje de entrada varió entre el 2,7 y el 10,7%, con un enriquecimiento que difiere entre los genes y los loci dentro del mismo gen.
Con suerte, la comprensión de la regulación epigenética de los cnidarios en respuesta a los cambios ambientales causados por la crisis climática podría informar los esfuerzos de conservación y restauración de los arrecifes de coral.
