Este trabajo cuenta con el apoyo de la Asociación Juvenil de Promoción de la Innovación CAS (2021084) y el Fondo de Apoyo al Proyecto de Despliegue Clave del Plan de Acción Trienal del Instituto de Microbiología de la Academia China de Ciencias.

1. Preparación de plantas de N. benthamiana 
<ol><li>Coloque los bloques de plántulas en una bandeja, agregue 1 L de agua y remoje durante aproximadamente 2 h hasta que estén completamente saturados.</li>
	<li>Espolvoree uniformemente las semillas de N. benthamiana de tipo silvestre en los bloques de plántulas, cúbralos con una tapa y germine durante 1 semana. Cultivar N. benthamiana en un invernadero con fotoperiodo de 18 h, 24 °C, 45% de humedad relativa y fertilizar cada 2 semanas.</li>
	<li>Una vez que las semillas hayan brotado, use pinzas para quitar suavemente una plántula, teniendo cuidado de no dañar sus raíces. Cava un pequeño hoyo en el centro de una bandeja nueva, coloca la plántula en él y cubre las raíces ligeramente con tierra. Cubra con una tapa y continúe creciendo.</li>
	<li>Crezca hasta que las plántulas tengan tres hojas, con la tapa puesta. Retire la tapa cuando emerja la4ª hoja verdadera.</li>
	<li>Permita que las plantas continúen creciendo durante dos semanas más antes de la agroinfiltración.</li>
</ol>2. Construcción de la GFP-His recombinante
<ol><li>Realizar la optimización y síntesis de codones de N. benthamiana de GFP y PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) a partir de las secuencias de genes.</li>
	<li>Realizar la doble digestión del vector pCAMBIA1300 utilizando las enzimas Xba I y Sac I (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Realice la amplificación de PR1a utilizando cebadores ascendentes (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT TGTTCTCTTTTC) y cebadores posteriores (TCCTCG CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA GTGGG), amplificación de GFP utilizando cebadores ascendentes (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG CAAGGGCGAGGA) y cebadores descendentes (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG GTGAGATCTTCCGGACTTGT).</li>
	<li>Usando recombinación homóloga, clona PR1a y GFP en el vector de expresión de plantas pCAMBIA1300. Después de la transferencia a E. coli, seleccione clones individuales y envíelos a la empresa para su secuenciación. La comparación de los resultados de la secuenciación y el plásmido correcto es el plásmido recombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, denominado p35s-PR1a-GFP-His.</li>
</ol>3. Producción de GFP-His en N. benthamiana
<ol><li>Agregue 1 μL de plásmido GFP en 50 μL de células receptoras Agrobacterium GV3101, mezcle suavemente y agregue a la copa de electrodos, retire después de la electrocución en el electrochoque.</li>
	<li>Esparcir Agrobacterium tumefaciens transformado en una placa de medio sólido LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina (Kan) y 50 μg/mL de rifampicina (Rif). Incubar invertido a 28 °C durante 48 h. El vector pCAMBIA1300 es resistente a kan y Agrobacterium es resistente a rif; solo el Agrobacterium correcto puede crecer en placas con Kan y Rif. Los clones monoclonales fueron los transformantes positivos, denominados A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).</li>
	<li>Use un palillo de dientes esterilizado para recoger una cantidad adecuada de AtGPG e inocularla en 4 mL de LB líquido con Kan y Rif. Cultivo a 28 °C, 220-300 rpm durante 24 h.</li>
	<li>Subcultivar bacterias 1:50 en LB fresco (50 μg/mL de Kan, 10 mM de ácido etanosulfónico (MES) 2-(N-Morfolino), 20 μM de acetosiringona (AS)) e incubar a 28 °C, 220-300 rpm durante 10-12 h.</li>
	<li>Recolectar las bacterias por centrifugación a 1500 x g durante 10 min y resuspender el pellet con 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 100 μM AS).</li>
	<li>Mida y ajuste la densidad óptica (OD) de AtGPG a OD600 = 0.8 usando MMA. Incubar las bacterias durante otras 2-4 h a temperatura ambiente. Extraiga la solución bacteriana con una jeringa sin aguja, presiónela ligeramente contra la parte posterior de las hojas y ejerza presión para que la solución penetre en las hojas. Inyecte solo las 3-4 hojas del medio por planta.</li>
	<li>Continúe cultivando N. benthamiana en el invernadero durante 3-4 días antes de cosechar las hojas para la extracción de proteínas.</li>
</ol>4. Observación de la localización subcelular de GFP
<ol><li>Después de 48 h de agroinfiltración, seleccione una hoja plana y utilice un perforador de 6 mm para sujetar la hoja para perforar.</li>
	<li>Gotee la solución de sacarosa al 30% en un portaobjetos de vidrio, coloque la muestra de hoja con el dorso hacia arriba y cúbrala con un cubreobjetos.</li>
	<li>Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nm y detecte la fluorescencia verde a 490-550 nm después de un aumento de 400x. Haz la primera foto una vez que la diapositiva esté preparada y otra 10 min después.</li>
</ol>5. Extracción de GFP de la planta
<ol><li>Extracción AWF<ol><li>Recoja las hojas frescas intactas de N. benthamiana que expresan GFP recombinante a los 3 días después de la agroinfiltración. Trate la hoja con suavidad y mantenga la integridad de la hoja para evitar el flujo de proteínas intracelular. Use las hojas recolectadas para el siguiente paso inmediatamente para evitar la degradación de proteínas.</li>
		<li>Enjuague la hoja con ddH2O esterilizado preenfriado para eliminar los desechos.</li>
		<li>Pesar las hojas frescas y sumergir 20 g de hojas (con el lado abaxial hacia abajo) en 100 mL de tampón de fosfato de 100 mM preenfriado (PB 100 mM Na2HPO4 y 100 mM NaH2PO4 se configuraron por separado y se mezclaron en una proporción de 2,2:1 pH 7,0) en un vaso de precipitados de boca ancha de 200 mL. Cubra las hojas con hilo de malla fina de nailon de malla 100 (consulte la tabla de materiales) y un plato de plástico. NOTA: El preenfriamiento evita la degradación de las proteínas. Los volúmenes de tampón se pueden ajustar en función de la escala experimental. Asegúrese de que todas las hojas estén sumergidas.</li>
		<li>Coloque el vaso de precipitados en una bomba de vacío. Aplique una aspiradora de 0,8 MPa durante 1 minuto y, a continuación, restablezca rápidamente la presión atmosférica.</li>
		<li>Retire las hojas del tampón y séquelas suavemente con papel absorbente. Enrolle las hojas, envuélvalas con hilo de malla y coloque 5 g de hojas en cada tubo de centrífuga de 50 ml. Para recoger AWF, coloque las hojas enrolladas con la punta hacia arriba en tubos con hilo de malla sujeto por las tapas de los tubos.</li>
		<li>Centrifugar a 4 °C, 500 x g durante 5 min. Retire las hojas y recoja el AWF en el fondo del tubo con una pipeta. Se pueden obtener aproximadamente 5 mL de AWF de cada tubo. NOTA: Para minimizar la interferencia de las proteínas intracelulares y extraer la máxima cantidad de proteínas AWF, la extracción se puede repetir 2x-3x, pero no más de 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de proteínas solubles totales<ol><li>Muele 20 g de hojas hasta convertirlas en polvo fino en nitrógeno líquido. Agregue tampón de extracción (50 mM de Tris-HCl pH 7.4, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 0.034% de β-mercaptoetanol (ver Tabla de Materiales)) en una proporción de 1:2.</li>
		<li>Agitar homogeneizar en una batidora vertical durante 30 min a 4 °C. Homogeneizar la centrífuga a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y repita la centrifugación durante 15 min. Transfiera el sobrenadante aclarado a otro tubo.</li>
		<li>Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de Materiales) para obtener extracto de proteína soluble total.</li>
	</ol></li>
</ol>  
6. Purificación de GFP-His con cromatografía de afinidad de níquel (Ni)
NOTA: Realice todos los pasos a 4 °C.
<ol><li>Agregue resina Ni sepharose excel (ver Tabla de materiales) a un tubo en una proporción de 1:1000 en relación con el volumen del extracto de proteína del paso 5.1.6. El volumen de resina es igual a 1/1000del volumen del extracto proteico.</li>
	<li>Lave la resina Ni 3x con un volumen de resina 10x de ddH, 2, O y PB (pH 7.0) por separado, a su vez, y elimine el sobrenadante.</li>
	<li>Incubar el extracto proteico con resina de Ni durante 2 h para permitir una unión completa. Centrifugar a 500 x g durante 5 min para eliminar las proteínas no unidas en el sobrenadante. Lavar 3 veces con un volumen de resina 20x de PB. Centrifugar a 500 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Eluir GFP-His añadiendo 10 veces el volumen de resina de 250 mM de imidazol (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 250 mM de imidazol) y recoger el sobrenadante.</li>
</ol>7. Tinción de proteínas con azul de Coomassie
<ol><li>Añada 10 μL de tampón de carga 5x SDS a 40 μL de muestras de proteína, hierva durante 10 min, luego ejecute en SDS-PAGE al 15% a 110 V durante 60 min.</li>
	<li>Tiñir geles de proteínas con solución de azul de Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% ácido acético glacial) durante 2 h.</li>
	<li>Vierta la solución y lave con solución decolorante durante 2 h. Observa el gel; Las proteínas del gel serán de color azul.</li>
</ol>8. Western blot de proteínas
<ol><li>Añada 10 μL de tampón de carga 5x SDS a 40 μL de muestras de proteína, hierva durante 10 min, luego ejecute en SDS-PAGE al 15% a 110 V durante 60 min.</li>
	<li>Transfiere proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm a 280 mA. Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% durante 1 h.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos anti-His-tag a 1:5000 e incubar la membrana con los anticuerpos durante 1 h. Use la solución salina tamponada con tris y tween 20 (TBST) para lavar la membrana 4 veces durante 5 minutos.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos anti-ratón a 1:10000 e incubar la membrana con los anticuerpos durante 1 h. Use TBST para lavar la membrana 4 veces durante 5 min.</li>
	<li>Mezcle el revelador (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1. Añadir 400 μL a la membrana y dejar reaccionar durante 1 min. Tome fotografías después de 1 minuto de exposición con un visualizador.</li>
</ol>9. Ensayo de concentración de proteínas
<ol><li>Agregue 5 μL de proteína a 1 mL de reactivo de colorante Bradford 1x y reaccione durante 5 min.</li>
	<li>Determine el valor de OD595 después de la puesta a cero y calcule la concentración de proteínas a partir de la curva estándar.</li>
</ol>10. Cuantificación de proteínas 31
<ol><li>Realice la transferencia occidental de muestras de proteínas junto con estándares.</li>
	<li>Realice la cuantificación de GFP por relación con los estándares utilizando el análisis en escala de grises ImageJ 1.5.0.</li>
</ol>

Extracción y purificación eficiente de GFP-His de hojas de N. benthamiana

<ol>
	<li>Zahmanova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+biologics:+Harnessing+the+power+of+plants+to+produce+pharmaceuticals.">Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals.</a> Int J Mol Sci. 24 (24), 1757 (2023).</li><li>PREVAIL II Writing Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+controlled+trial+of+ZMapp+for+Ebola+virus+infection.">A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection.</a> N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).</li><li>Ma, J. K. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leaf+plasticity+on+the+isolation+of+apoplastic+fluid+from+leaves+of+tartary+buckwheat+plants+grown+in+vivo+and+in+vitro.">The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro.</a> Plants. 12 (23), 4048 (2023).</li><li>Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+quantitation+of+apoplast+hydration+in+Arabidopsis+leaves+reveals+water-soaking+activity+of+effectors+of+Pseudomonas+syringae+during+biotrophy.">A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy.</a> Sci Rep. 12 (1), 18363 (2022).</li><li>Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+phaseolus+vulgaris+as+an+example.">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example.</a> J Vis Exp. (94), e52113 (2014).</li><li>Nandi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+and+economic+evaluation+of+recombinant+human+lactoferrin+expressed+in+rice+grain.">Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain.</a> Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).</li><li>Menkhaus, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants.">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li><li>Streatfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+achieve+high-level+heterologous+protein+production+in+plants.">Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants.</a> Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+transient+expression+system+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants.">Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants.</a> Sci Rep. 8 (1), 4755 (2018).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Apoplast-localized+lipid+transfer+protein+TaLTP3+enhances+defense+responses+against+Puccinia+triticina.">Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina.</a> Front Plant Sci. 12, 771806 (2021).</li><li>Venkataraman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+expression+and+purification+strategies+for+plant+made+vaccines.">Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines.</a> Front Plant Sci. 14, 1273958 (2023).</li><li>Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+extraction+methods+for+apoplastic+proteins+from+maize+leaves.">Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves.</a> Plant Meth. 7, 48 (2011).</li></ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

El uso de plantas para producir proteínas terapéuticas se ha expandido rápidamente en los últimos años 1,2,3,4,5,6. Los genes que codifican proteínas se clonan en vectores de expresión y se introducen en los tejidos de las plantas mediante agroinfiltración. Después de la producción por parte de las células vegetale...

Hoy en día, se están estudiando varias proteínas terapéuticas recombinantes producidas por plantas, incluidos anticuerpos, vacunas, proteínas bioactivas, enzimas y pequeños polipéptidos 1,2,3,4,5,6. Las plantas se están convirtiendo en una plataforma cada vez más utilizada para la producción de proteínas terapéuticas debido a su seguridad, bajo costo y capacidad para escalar rápidamente la producción 7,8. La expresión y modificación de proteínas en los sistemas vegetales, junto con la purificación de proteínas, son factores críticos que determinan la productividad de los biorreactores vegetales 9,10. La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son los principales retos a los que se enfrentan los sistemas de producción basados en plantas11,12.
La localización subcelular y la modificación de las proteínas recombinantes dependen del péptido señal específico codificado en el extremo N-terminal, que dirige la proteína a su destino final del orgánulo durante la expresión génica. Las proteínas recombinantes están diseñadas para localizarse en el apoplasto, el retículo endoplásmico (RE), el cloroplasto, la vacuola o el citoplasma, en función de sus propiedades únicas13. Para los antígenos y anticuerpos, se prefieren las proteínas secretadas. Antes de la secreción, las proteínas progresan a través de RE y Golgi para un correcto plegamiento y modificaciones postraduccionales 14,15,16.
Después de la producción en plantas, las proteínas recombinantes deben purificarse a partir de extractos de plantas. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales, que contienen abundantes proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos17. Para eliminar las impurezas, los extractos de plantas se someten a un fraccionamiento extenso, que incluye cromatografía de afinidad específica de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), precipitación de fitatos, precipitación de polietilenglicol y ajuste de temperatura y pH18,19. Estos pasos de eliminación de impurezas son laboriosos y pueden comprometer la calidad de la proteína.
El compartimento de la célula vegetal más allá de la membrana plasmática se define como el apoplasto, que abarca la pared celular, los espacios intercelulares y el xilema20. La fase acuosa se denomina comúnmente fluido de lavado apoplasto (AWF). AWF contiene moléculas secretadas por las células para regular numerosos avances biológicos como el transporte, el metabolismo de la pared celular y las respuestas al estrés21,22. A diferencia de TSP, los constituyentes moleculares de AWF son menos complejos. La extracción de proteínas recombinantes de AWF puede evitar la contaminación por proteínas intracelulares, productos mal plegados y restos citoplasmáticos. Brevemente, el lípido de extracción ingresa a las hojas a través de los estomas bajo presión negativa, y el AWF se recolecta por centrifugación suave23. Si bien el aislamiento de AWF se emplea ampliamente para estudiar el progreso biológico dentro del apoplasto 24,25,26,27, no se ha explotado en sistemas de producción basados en plantas.
La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son desafíos centrales para los sistemas de producción de plantas28. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales que contienen grandes cantidades de proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos29, que requieren grandes costos para su posterior purificación30. El uso de métodos de extracción de proteínas AWF para la extracción de proteínas recombinantes exógenas secretadas en apoplasto puede mejorar eficazmente la homogeneidad de las proteínas recombinantes y reducir el costo de la purificación de proteínas. Aquí, utilizamos un péptido señal PR1a para permitir la secreción de proteínas exógenas en el espacio apoplasto e introducimos un método detallado para la purificación de proteínas recombinantes a partir del AWF de N. benthamiana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mesh nylon fine mesh yarn</td>
			<td>Guangzhou Huayu Trading limited company</td>
			<td>hy-230724-2</td>
			<td>For AWF protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>TCF00150</td>
			<td>For centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClonExpress II one step cloning kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>C112-02</td>
			<td>For clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest Sac1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td>For clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>FD0685</td>
			<td>For clone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ 1.5.0</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>For greyscale analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large filter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NEST</td>
			<td>For filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscopy</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td>For subcellular localization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni sepharose excel</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>10339806</td>
			<td>For protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast protein plus gel</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>36246ES10</td>
			<td>For SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>1660045</td>
			<td>For filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>34076</td>
			<td>For western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SCR</td>
			<td>30188928</td>
			<td>To configure the extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type rotaryvang vacuum pump</td>
			<td>Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company</td>
			<td>2XZ-2</td>
			<td>For vacuum infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical mixer</td>
			<td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing limited company</td>
			<td>BE-1200</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>BCBK8223V</td>
			<td>To configure the extraction buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

apoplast-extraction based method to improve the purity of plant produced recombinant protein

Las plantas son un sistema de expresión eucariota en desarrollo reciente que se está explorando para producir proteínas terapéuticas. La purificación de proteínas recombinantes de plantas es uno de los pasos más críticos en el proceso de producción. Por lo general, las proteínas se purificaron a partir de proteínas solubles totales (TSP), y la presencia de proteínas intracelulares diversas y citocromos plantea desafíos para los pasos posteriores de purificación de proteínas. Además, la mayoría de las proteínas terapéuticas, como los antígenos y los anticuerpos, se secretan para obtener una glicosilación adecuada, y la presencia de proteínas modificadas incompletamente conduce a estructuras de antígenos o anticuerpos inconsistentes. Este trabajo introduce un método más eficaz para obtener proteínas recombinantes altamente purificadas a partir del espacio apoplástico de la planta. La proteína verde fluorescente recombinante (GFP) se diseña para ser secretada en el apoplasto de Nicotiana benthamiana y luego se extrae utilizando un método de infiltración-centrifugación. A continuación, el GFP-His del apoplasto extraído se purifica mediante cromatografía de afinidad de níquel. A diferencia de los métodos tradicionales de TSP, la purificación del apoplasto produce proteínas recombinantes altamente purificadas. Esto representa una importante mejora tecnológica para los sistemas de producción de las plantas.

Nowadays, various plant-produced recombinant therapeutic proteins are under study, including antibodies, vaccines, bioactive proteins, enzymes, and small polypeptides1,2,3,4,5,6. Plants are becoming an increasingly utilized platform for producing therapeutic proteins due to their safety, low cost, and ability to rapidly scale production7,8. Protein expression and modification in plant systems, along with protein purification, are critical factors determining the productivity of plant bioreactors9,10. Enhancing plant productivity and obtaining high-purity target proteins are core challenges facing plant-based production systems11,12.
The subcellular localization and modification of recombinant proteins depends on the specific signal peptide encoded at the N-terminus, which targets the protein to its final organelle destination during gene expression. Recombinant proteins are designed to localize to the apoplast, endoplasmic reticulum (ER), chloroplast, vacuole, or cytoplasm, based on their unique properties13. For antigens and antibodies, secreted proteins are preferred. Before secretion, proteins progress through ER and Golgi for correct folding and post-translational modifications14,15,16.
After production in plants, recombinant proteins must be purified from plant extracts. Typically, proteins are purified from total soluble plant extracts, which contain abundant intracellular proteins, misfolded and unmodified products, and cytochromes17. To remove impurities, plant extracts undergo extensive fractionation, including ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO)-specific affinity chromatography, phytate precipitation, polyethylene glycol precipitation, and adjustment of temperature and pH18,19. Such impurity-removal steps are laborious and can compromise protein quality.
The plant cell compartment beyond the plasma membrane is defined as the apoplast, encompassing the cell wall, intercellular spaces, and xylem20. The aqueous phase is commonly called apoplast washing fluid (AWF). AWF contains molecules secreted by cells to regulate numerous biological progresses like transport, cell wall metabolism, and stress responses21,22. In contrast to TSP, the molecular constituents of AWF are less complex. Extracting recombinant proteins from AWF may avoid contamination by intracellular proteins, misfolded products, and cytoplasmic remnants. Briefly, extraction lipid enters leaves through the stomata under negative pressure, and the AWF is collected by gentle centrifugation23. While isolation of AWF is widely employed to study the biological progress inside apoplast24,25,26,27, it has not been exploited in plant-based production systems.
Improving plant productivity and obtaining high purity target proteins are central challenges for plant production systems28. Typically, proteins are purified from total soluble plant extracts containing large amounts of intracellular proteins, misfolded and unmodified products, and cytochromes29, which require great costs for subsequent purification30. The use of AWF protein extraction methods for the extraction of exogenous recombinant proteins secreted into apoplast can effectively improve the homogeneity of recombinant proteins and reduce the cost of protein purification. Here, we use a signal peptide PR1a to enable exogenous protein secretion into the apoplast space and introduce a detailed method for recombinant protein purification from the AWF of N. benthamiana.

Autor destacado: Optimización de la extracción de proteínas Apoplast para la recuperación eficiente de proteínas recombinantes de células vegetales

Método basado en la extracción de apoplastos para mejorar la pureza de la proteína recombinante producida por plantas  

GFP-His es el objetivo de la secreción en el espacio apoplástico de N. benthamiana GFP se clonó en el plásmido pCAMBIA1300 con un péptido señal PR1a N-terminal para la secreción y una etiqueta His C-terminal para la purificación, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteína recombinante se expresó transitoriamente en N. benthamiana y se detectó una banda de 30 kDa mediante Western blot utilizando anticuerpo anti-His a ...

La purificación de proteínas recombinantes de sistemas vegetales generalmente se ve desafiada por las proteínas vegetales. Este trabajo proporciona un método para extraer y purificar eficazmente una proteína recombinante secretada del apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

apoplast-extraction-based-method-to-improve-purity-plant-produced

Research

JoVE Journal

Biology

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

754 vistas.  Shandong First Medical University. Investigamos cómo extraer proteínas recombinantes de células vegetales de manera más eficiente. Respondimos a la pregunta de si el método de extracción de proteínas apoplastas es factible cuando se aplica a las proteínas recombinantes. Este método de extracción extrae las proteínas secretadas en el apoplasto, por lo que tienen homogeneidad.No hay necesidad de disrupción celular, lo que reduce la interferencia de las proteínas intracelulare...

Video: Autor destacado: Optimización de la extracción de proteínas Apoplast para la recuperación eficiente de proteínas recombinantes de células vegetales

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.