Este trabalho é apoiado pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084) e pelo Fundo de Apoio ao Projeto de Implantação Chave do Plano de Ação Trienal do Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências.

1. Preparação de plantas de N. benthamiana
<ol><li>Coloque os blocos de mudas em uma bandeja, adicione 1 L de água e deixe de molho por aproximadamente 2 h até saturar totalmente.</li>
	<li>Polvilhe uniformemente sementes de N. benthamiana do tipo selvagem nos blocos de mudas, cubra com uma tampa e germine por 1 semana. Cultive N. benthamiana em estufa com fotoperíodo de 18 h, 24 °C, 45% de umidade relativa e fertilize a cada 2 semanas.</li>
	<li>Depois que as sementes germinarem, use uma pinça para remover suavemente uma muda, tomando cuidado para não causar danos às raízes. Cave um pequeno buraco no centro de uma nova bandeja, coloque a muda nele e cubra as raízes levemente com terra. Cubra com uma tampa e continue a crescer.</li>
	<li>Cresça até que as mudas tenham três folhas, com a tampa. Remova a tampa quando a4ª folha verdadeira emergir.</li>
	<li>Deixe as plantas continuarem crescendo por mais duas semanas antes da infiltração agrícola.</li>
</ol>2. Construção do GFP-His recombinante
<ol><li>Realizar a otimização do códon de N. benthamiana e síntese de GFP e PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) com base nas sequências gênicas.</li>
	<li>Realizar a dupla digestão do vetor pCAMBIA1300 utilizando as enzimas Xba I e Sac I (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Realizar amplificação de PR1a usando primers a montante (TTGGAGAGAACACGGGACTCTAGAATGGGATT TGTTCTCTTTTC) e primers a jusante (TCCTCG CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA GTGGG), amplificação de GFP usando primers a montante (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG CAAGGGCGAGGA) e primers a jusante (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG GTGAGATCTTCCGGACTTGT).</li>
	<li>Usando recombinação homóloga, clone PR1a e GFP no vetor de expressão de plantas pCAMBIA1300. Após a transferência para E. coli, selecione clones únicos e envie-os para a empresa para sequenciamento. A comparação dos resultados do sequenciamento e do plasmídeo correto é o plasmídeo recombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, conhecido como p35s-PR1a-GFP-His.</li>
</ol>3. Produção de GFP-His em N. benthamiana
<ol><li>Adicione 1 μL de plasmídeo GFP em 50 μL de células receptoras de Agrobacterium GV3101, misture delicadamente e adicione ao copo do eletrodo, remova após a eletrocussão no eletrochoque.</li>
	<li>Espalhe Agrobacterium tumefaciens transformado em uma placa de meio sólido LB contendo 50 μg/mL de canamicina (Kan) e 50 μg/mL de rifampicina (Rif). Incubar invertido a 28 °C durante 48 h. O vetor pCAMBIA1300 é resistente a kan e Agrobacterium é resistente a rif; apenas o Agrobacterium correto pode crescer em placas com kan e rif. Os clones monoclonais foram os transformantes positivos, denominados A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).</li>
	<li>Use um palito esterilizado para coletar uma quantidade adequada de AtGPG e inoculá-lo em 4 mL de LB líquido com Kan e Rif. Cultura a 28 °C, 220-300 rpm durante 24 h.</li>
	<li>Subcultive bactérias 1:50 em LB fresco (50 μg/mL Kan, 10 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico (MES), 20 μM de acetosiringona (AS)) e incube a 28 °C, 220-300 rpm por 10-12 h.</li>
	<li>Colha bactérias por centrifugação a 1500 x g por 10 min e ressuspenda o pellet com 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 100 μM AS).</li>
	<li>Meça e ajuste a densidade óptica (OD) de AtGPG para OD600 = 0,8 usando MMA. Incube as bactérias por mais 2-4 h em temperatura ambiente. Retire a solução bacteriana com uma seringa sem agulha, pressione-a levemente contra a parte de trás das folhas e pressione para penetrar a solução nas folhas. Injete apenas as 3-4 folhas do meio por planta.</li>
	<li>Continue a cultivar N. benthamiana na estufa por 3-4 dias antes de colher as folhas para extração de proteínas.</li>
</ol>4. Observando a localização subcelular da GFP
<ol><li>Após 48 h de agroinfiltração, selecione uma folha plana e use um furador de 6 mm para prender a lâmina para perfuração.</li>
	<li>Pingue a solução de sacarose a 30% em uma lâmina de vidro, coloque a amostra de folha com as costas voltadas para cima e cubra-a com uma lamínula.</li>
	<li>Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nm e detecte a fluorescência verde em 490-550 nm após ampliação de 400x. Tire a primeira foto assim que o slide estiver preparado e outra 10 minutos depois.</li>
</ol>5. Extraindo GFP da planta
<ol><li>Extração AWF<ol><li>Colete as folhas frescas intactas de N. benthamiana expressando GFP recombinante 3 dias após a agroinfiltração. Trate a folha com cuidado e mantenha a integridade da folha para evitar o efluxo de proteína intracelular. Use as folhas coletadas para a próxima etapa imediatamente para evitar a degradação da proteína.</li>
		<li>Enxágue a lâmina da folha com ddH2O esterilizado pré-resfriado para remover detritos.</li>
		<li>Pese as folhas frescas e mergulhe 20 g de folhas (lado abaxial para baixo) em 100 mL de tampão fosfato 100 mM pré-resfriado (PB 100 mM Na2HPO4 e 100 mM NaH2PO4 foram configurados separadamente e misturados na proporção de 2,2:1 pH 7,0) em um béquer de boca larga de 200 mL. Cubra as folhas com fio de malha fina de nylon de malha 100 (consulte a Tabela de Materiais) e uma placa de plástico. NOTA: O pré-resfriamento evita a degradação da proteína. Os volumes de buffer podem ser ajustados com base na escala experimental. Certifique-se de que todas as folhas estejam imersas.</li>
		<li>Coloque o copo em uma bomba de vácuo. Aplique vácuo de 0,8 MPa por 1 min e, em seguida, restaure rapidamente a pressão atmosférica.</li>
		<li>Remova as folhas do tampão e seque suavemente com papel absorvente. Enrole as folhas, embrulhe com fio de malha e coloque 5 g de folhas em cada tubo de centrífuga de 50 mL. Para coletar AWF, posicione as folhas enroladas com a ponta para cima em tubos com fio de malha preso pelas tampas dos tubos.</li>
		<li>Centrifugue a 4 °C, 500 x g durante 5 min. Remova as folhas e colete o AWF no fundo do tubo usando uma pipeta. Cerca de 5 mL de AWF podem ser obtidos de cada tubo. NOTA: Para minimizar a interferência das proteínas intracelulares e extrair a quantidade máxima de proteínas AWF, a extração pode ser repetida 2x-3x, mas não mais do que 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de proteína solúvel total<ol><li>Moer 20 g de folhas em pó fino em nitrogênio líquido. Adicione tampão de extração (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 0,034% de β-mercaptoetanol (ver Tabela de Materiais)) na proporção de 1: 2.</li>
		<li>Agitar o homogeneizado num misturador vertical durante 30 min a 4 °C. Homogeneizar a centrífuga a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transferir o sobrenadante para um novo tubo e repetir a centrifugação durante 15 min. Transferir o sobrenadante limpo para outro tubo.</li>
		<li>Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais) para obter o extracto de proteína solúvel total.</li>
	</ol></li>
</ol>  
6. Purificação de GFP-His com cromatografia de afinidade de níquel (Ni)
NOTA: Execute todas as etapas a 4 °C.
<ol><li>Adicione a resina Ni sepharose excel (consulte a Tabela de Materiais) a um tubo na proporção de 1:1000 em relação ao volume do extrato de proteína da etapa 5.1.6. O volume da resina é igual a 1/1000do volume do extrato proteico.</li>
	<li>Lave a resina de Ni 3x com 10x o volume de resina de ddH2O e PB (pH 7,0) separadamente e remova o sobrenadante.</li>
	<li>Incube o extrato de proteína com resina de Ni por 2 h para permitir a ligação total. Centrifugue a 500 x g por 5 min para remover proteínas não ligadas no sobrenadante. Lave 3x com 20x o volume de resina de PB. Centrifugue a 500 x g por 5 min e remova o sobrenadante.</li>
	<li>Eluir GFP-His adicionando 10x volume de resina de 250 mM de imidazol (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 250 mM de imidazol) e colete o sobrenadante.</li>
</ol>7. Coloração de proteínas com azul de Coomassie
<ol><li>Adicione 10 μL de tampão de carga 5x SDS a 40 μL de amostras de proteína, ferva por 10 min e depois execute em 15% SDS-PAGE a 110 V por 60 min.</li>
	<li>Géis de proteína de coloração com solução de azul de Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% de ácido acético glacial) por 2 h.</li>
	<li>Despeje a solução e lave com solução descolorante por 2 h. Observe o gel; As proteínas no gel serão coloridas em azul.</li>
</ol>8. Western blotting de proteínas
<ol><li>Adicione 10 μL de tampão de carga 5x SDS a 40 μL de amostras de proteína, ferva por 10 min e depois execute em 15% SDS-PAGE a 110 V por 60 min.</li>
	<li>Transfira proteínas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm a 280 mA. Bloqueie a membrana com 5% de leite desnatado por 1 h.</li>
	<li>Diluir os anticorpos anti-His-tag a 1:5000 e incubar a membrana com os anticorpos durante 1 h. Use a solução salina tamponada com tris e tween 20 (TBST) para lavar a membrana 4x por 5 min.</li>
	<li>Diluir os anticorpos anti-ratinho a 1:10000 e incubar a membrana com os anticorpos durante 1 h. Use TBST para lavar a membrana 4x por 5 min.</li>
	<li>Misture o revelador (consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:1. Adicione 400 μL à membrana e deixe reagir por 1 min. Tire fotografias após 1 min de exposição com um visualizador.</li>
</ol>9. Ensaio de concentração de proteína
<ol><li>Adicione 5 μL de proteína a 1 mL de reagente de corante Bradford 1x e reaja por 5 min.</li>
	<li>Determine o valor OD595 após zeragem e calcule a concentração de proteína a partir da curva padrão.</li>
</ol>10. Quantificação de proteínas 31
<ol><li>Realize Western blotting de amostras de proteínas junto com os padrões.</li>
	<li>Realize a quantificação de GFP por proporção com os padrões usando a análise em escala de cinza ImageJ 1.5.0.</li>
</ol>

Extração e purificação eficientes de GFP-His de folhas de N. benthamiana

<ol>
	<li>Zahmanova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+biologics:+Harnessing+the+power+of+plants+to+produce+pharmaceuticals.">Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals.</a> Int J Mol Sci. 24 (24), 1757 (2023).</li><li>PREVAIL Writing Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+controlled+trial+of+ZMapp+for+Ebola+virus+infection.">A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection.</a> N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).</li><li>Ma, J. K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+achieve+high-level+heterologous+protein+production+in+plants.">Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants.</a> Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).</li><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+transient+expression+system+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants.">Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants.</a> Sci Rep. 8 (1), 4755 (2018).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Apoplast-localized+lipid+transfer+protein+TaLTP3+enhances+defense+responses+against+Puccinia+triticina.">Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina.</a> Front Plant Sci. 12, 771806 (2021).</li><li>Venkataraman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+expression+and+purification+strategies+for+plant+made+vaccines.">Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines.</a> Front Plant Sci. 14, 1273958 (2023).</li><li>Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., M&#252;hling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+extraction+methods+for+apoplastic+proteins+from+maize+leaves.">Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves.</a> Plant Meth. 7, 48 (2011).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

O uso de plantas para produzir proteínas terapêuticas expandiu-se rapidamente nos últimos anos 1,2,3,4,5,6. Os genes codificadores de proteínas são clonados em vetores de expressão e entregues aos tecidos vegetais por meio de agroinfiltração. Após a produção por células vegetais, as proteínas são purificadas par...

Atualmente, várias proteínas terapêuticas recombinantes produzidas em plantas estão em estudo, incluindo anticorpos, vacinas, proteínas bioativas, enzimas e pequenos polipeptídeos 1,2,3,4,5,6. As plantas estão se tornando uma plataforma cada vez mais utilizada para a produção de proteínas terapêuticas devido à sua segurança, baixo custo e capacidade de escalar rapidamente a produção 7,8. A expressão e modificação de proteínas em sistemas vegetais, juntamente com a purificação de proteínas, são fatores críticos que determinam a produtividade dos biorreatores vegetais 9,10. Aumentar a produtividade das plantas e obter proteínas-alvo de alta pureza são os principais desafios enfrentados pelos sistemas de produção à base de plantas11,12.
A localização subcelular e a modificação de proteínas recombinantes dependem do peptídeo sinal específico codificado no terminal N, que direciona a proteína para seu destino final de organela durante a expressão gênica. As proteínas recombinantes são projetadas para se localizar no apoplasto, retículo endoplasmático (RE), cloroplasto, vacúolo ou citoplasma, com base em suas propriedades únicas13. Para antígenos e anticorpos, as proteínas secretadas são preferidas. Antes da secreção, as proteínas progridem através de ER e Golgi para dobramento correto e modificações pós-traducionais 14,15,16.
Após a produção em plantas, as proteínas recombinantes devem ser purificadas a partir de extratos vegetais. Normalmente, as proteínas são purificadas a partir de extratos vegetais solúveis totais, que contêm proteínas intracelulares abundantes, produtos mal dobrados e não modificados e citocromos17. Para remover as impurezas, os extratos vegetais passam por um extenso fracionamento, incluindo cromatografia de afinidade específica da ribulose-1,5-bifosfato carboxilase / oxigenase (RuBisCO), precipitação de fitato, precipitação de polietilenoglicol e ajuste de temperatura e pH18,19. Essas etapas de remoção de impurezas são trabalhosas e podem comprometer a qualidade da proteína.
O compartimento da célula vegetal além da membrana plasmática é definido como o apoplasto, abrangendo a parede celular, os espaços intercelulares e o xilema20. A fase aquosa é comumente chamada de fluido de lavagem apoplasto (AWF). AWF contém moléculas secretadas pelas células para regular vários progressos biológicos, como transporte, metabolismo da parede celular e respostas ao estresse21,22. Em contraste com o TSP, os constituintes moleculares do AWF são menos complexos. A extração de proteínas recombinantes da AWF pode evitar a contaminação por proteínas intracelulares, produtos mal dobrados e remanescentes citoplasmáticos. Resumidamente, o lipídio de extração entra nas folhas através dos estômatos sob pressão negativa, e o AWF é coletado por centrifugação suave23. Embora o isolamento de AWF seja amplamente empregado para estudar o progresso biológico dentro do apoplast 24,25,26,27, ele não foi explorado em sistemas de produção baseados em plantas.
Melhorar a produtividade das plantas e obter proteínas-alvo de alta pureza são desafios centrais para os sistemas de produção de plantas28. Normalmente, as proteínas são purificadas a partir de extratos vegetais solúveis totais contendo grandes quantidades de proteínas intracelulares, produtos mal dobrados e não modificados e citocromos29, que requerem grandes custos para purificação subsequente30. O uso de métodos de extração de proteínas AWF para a extração de proteínas recombinantes exógenas secretadas em apoplasto pode efetivamente melhorar a homogeneidade das proteínas recombinantes e reduzir o custo da purificação de proteínas. Aqui, usamos um peptídeo sinal PR1a para permitir a secreção de proteínas exógenas no espaço apoplastoso e introduzimos um método detalhado para purificação de proteínas recombinantes do AWF de N. benthamiana.

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		</tr>
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apoplast-extraction based method to improve the purity of plant produced recombinant protein  

As plantas são um sistema de expressão eucariótico em desenvolvimento que está sendo explorado para produzir proteínas terapêuticas. A purificação de proteínas recombinantes de plantas é uma das etapas mais críticas do processo de produção. Normalmente, as proteínas foram purificadas a partir de proteínas solúveis totais (TSP), e a presença de diversas proteínas intracelulares e citocromos apresenta desafios para as etapas subsequentes de purificação de proteínas. Além disso, a maioria das proteínas terapêuticas, como antígenos e anticorpos, são secretadas para obter glicosilação adequada, e a presença de proteínas incompletamente modificadas leva a estruturas inconsistentes de antígenos ou anticorpos. Este trabalho apresenta um método mais eficaz para obter proteínas recombinantes altamente purificadas do espaço apoplástico vegetal. A proteína fluorescente verde recombinante (GFP) é projetada para ser secretada no apoplasto de Nicotiana benthamiana e é então extraída usando um método de infiltração-centrifugação. O GFP-His do apoplasto extraído é então purificado por cromatografia de afinidade de níquel. Em contraste com os métodos tradicionais do TSP, a purificação do apoplasto produz proteínas recombinantes altamente purificadas. Isso representa uma importante melhoria tecnológica para os sistemas de produção vegetal.

Nowadays, various plant-produced recombinant therapeutic proteins are under study, including antibodies, vaccines, bioactive proteins, enzymes, and small polypeptides1,2,3,4,5,6. Plants are becoming an increasingly utilized platform for producing therapeutic proteins due to their safety, low cost, and ability to rapidly scale production7,8. Protein expression and modification in plant systems, along with protein purification, are critical factors determining the productivity of plant bioreactors9,10. Enhancing plant productivity and obtaining high-purity target proteins are core challenges facing plant-based production systems11,12.
The subcellular localization and modification of recombinant proteins depends on the specific signal peptide encoded at the N-terminus, which targets the protein to its final organelle destination during gene expression. Recombinant proteins are designed to localize to the apoplast, endoplasmic reticulum (ER), chloroplast, vacuole, or cytoplasm, based on their unique properties13. For antigens and antibodies, secreted proteins are preferred. Before secretion, proteins progress through ER and Golgi for correct folding and post-translational modifications14,15,16.
After production in plants, recombinant proteins must be purified from plant extracts. Typically, proteins are purified from total soluble plant extracts, which contain abundant intracellular proteins, misfolded and unmodified products, and cytochromes17. To remove impurities, plant extracts undergo extensive fractionation, including ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO)-specific affinity chromatography, phytate precipitation, polyethylene glycol precipitation, and adjustment of temperature and pH18,19. Such impurity-removal steps are laborious and can compromise protein quality.
The plant cell compartment beyond the plasma membrane is defined as the apoplast, encompassing the cell wall, intercellular spaces, and xylem20. The aqueous phase is commonly called apoplast washing fluid (AWF). AWF contains molecules secreted by cells to regulate numerous biological progresses like transport, cell wall metabolism, and stress responses21,22. In contrast to TSP, the molecular constituents of AWF are less complex. Extracting recombinant proteins from AWF may avoid contamination by intracellular proteins, misfolded products, and cytoplasmic remnants. Briefly, extraction lipid enters leaves through the stomata under negative pressure, and the AWF is collected by gentle centrifugation23. While isolation of AWF is widely employed to study the biological progress inside apoplast24,25,26,27, it has not been exploited in plant-based production systems.
Improving plant productivity and obtaining high purity target proteins are central challenges for plant production systems28. Typically, proteins are purified from total soluble plant extracts containing large amounts of intracellular proteins, misfolded and unmodified products, and cytochromes29, which require great costs for subsequent purification30. The use of AWF protein extraction methods for the extraction of exogenous recombinant proteins secreted into apoplast can effectively improve the homogeneity of recombinant proteins and reduce the cost of protein purification. Here, we use a signal peptide PR1a to enable exogenous protein secretion into the apoplast space and introduce a detailed method for recombinant protein purification from the AWF of N. benthamiana.

Autor em destaque: Otimizando a extração de proteínas Apoplast para recuperação eficiente de proteínas recombinantes de células vegetais

Método baseado em extração de apoplastos para melhorar a pureza da proteína recombinante produzida pela planta  

We investigated how to extract recombinant proteins from plant cells more efficiently. We answered the question of whether the apoplast protein extraction method is feasible when applied to the recombinant proteins. This extraction method extracts proteins secreted into the apoplast, so they have homogeneity.There is no need for cell disruption, which reduce the interference from intracellular proteins and the subsequent purification costs. We will focus on how to increase the secretion of recombinant proteins in the apoplast space to further improve the efficiency of the apoplast protein extraction method.

GFP-His é alvo de secreção no espaço apoplástico de N. benthamiana A GFP foi clonada no plasmídeo pCAMBIA1300 com um peptídeo sinal N-terminal PR1a para secreção e um His-tag C-terminal para purificação, gerando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). A proteína recombinante foi expressa transitoriamente em N. benthamiana e uma banda de 30 kDa foi detectada por western blot usando anticorpo anti-His 3 dias após a agroinfiltração <s...

A purificação de proteínas recombinantes de sistemas vegetais é geralmente desafiada por proteínas vegetais. Este trabalho fornece um método para extrair e purificar efetivamente uma proteína recombinante secretada do apoplasto de Nicotiana benthamiana.

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

apoplast-extraction-based-method-to-improve-purity-plant-produced

Research

JoVE Journal

Biology

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein  

651 visualizações.  Shandong First Medical University. Investigamos como extrair proteínas recombinantes de células vegetais de forma mais eficiente. Respondemos à questão de saber se o método de extração da proteína do apoplasto é viável quando aplicado às proteínas recombinantes. Este método de extração extrai proteínas secretadas no apoplasto, para que tenham homogeneidade.Não há necessidade de ruptura celular, o que reduz a interferência de proteínas intracelulares e os custos de pu...