Estudiamos nuestros canales relacionados con la sensación de temperatura, la sensación de edad y la sensación de dolor. Estamos interesados en el cribado de las actividades de las moléculas pequeñas en nuestros canales y el estudio de sus mecanismos. Hemos seleccionado dos agonistas activadores de TRPV1 y hemos realizado un estudio detallado de sus mecanismos de acción.
Esta tecnología permite el monitoreo en tiempo real, cuantitativo y simultáneo de los cambios de calcio en múltiples células, lo que lo convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación. Nuestro objetivo es explorar el mecanismo de tratamiento de la medicina tradicional china para las diversas enfermedades a través de la modernización de los canales iónicos relacionados con el calcio. Para comenzar, prepare portaobjetos de vidrio estéril de ocho milímetros de diámetro y colóquelos en una placa de 24 pocillos.
Agregue 500 microlitros de tampón Poly-D-licina a cada pocillo. Incubar los portaobjetos a 37 grados centígrados durante una hora para permitir el recubrimiento. Luego, con una pipeta, deseche la solución de recubrimiento de cada pocillo.
Lave los portaobjetos una vez con el PBS de Dulbecco y deje los portaobjetos lavados a un lado para su uso posterior. Siembre las células en la placa preparada de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 1,5 veces 10 elevado a la potencia de 5 células por pocillo, y coloque la placa en la incubadora hasta que las células se adhieran. A continuación, mezcle la solución madre Fura-2/AM y Pluronic F-127 con el tampón de Hank que contiene iones de calcio de 1,3 milimolares.
Con papel de aluminio, cubra la solución de trabajo Fura-2/AM para protegerla de la luz. Para el pretratamiento de las células, transfiera los portaobjetos de vidrio con las células a una nueva placa de 24 pocillos que contenga el tampón de Hank. Con una pipeta, deseche el tampón de cada pocillo y agregue 500 microlitros de tampón de trabajo Fura-2/AM a cada pocillo.
Incube la placa a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos para permitir la carga de la sonda. A continuación, retire el tampón de trabajo Fura-2/AM de cada pocillo y lave las celdas tres veces con el tampón de Hank para eliminar el exceso de Fura-2/AM. Para comenzar, obtenga las células pretratadas para obtener imágenes de calcio de una sola célula y comience todos los componentes del microscopio de fluorescencia.
Abra el software de imágenes de fluorescencia de las opciones disponibles. Seleccione el protocolo requerido y haga clic en Aceptar. A continuación, selecciona Nuevo experimento en el menú principal para iniciar una nueva configuración experimental.
Ahora, monte la cámara de perfusión en la platina del microscopio y coloque con cuidado los portaobjetos celulares tratados con Fura-2/AM en la cámara que contiene la solución tampón de Hank. Ajuste el enfoque bajo luz blanca para una visualización óptima. Seleccione Foco en el panel de control del experimento.
Elija la longitud de onda deseada para enfocar, como 380 nanómetros, y haga clic en Iniciar enfoque para iniciar los ajustes focales. Ajusta el enfoque en las celdas con Enfoque aproximado para acercar el objetivo, seguido de Buscar enfoque para ajustes precisos. Observe la expresión de la proteína objetivo por longitudes de onda de FITC o TRITC.
A continuación, haga clic en Dejar de enfocar y cierre el panel de enfoque. Haga clic en Configurar experimento en la barra de tareas y seleccione los pisos deseados para la creación de imágenes en los ajustes de configuración. Ahora haga clic en el botón Región en la barra de menú para definir áreas para la imagen y elija el tipo de iluminación deseada para la imagen.
Haga clic en Adquirir imágenes, luego presione Aceptar para capturar imágenes. Identifique las células deseadas que expresan la proteína objetivo bajo fluorescencia, considerando la lectura en blanco con los controles por debajo de 380 nanómetros. Para deshacer una región seleccionada, haga clic con el botón derecho en el círculo y seleccione Eliminar región.
Abra el menú Referencias, marque la casilla Restar referencias y, a continuación, haga clic en Aceptar para aplicar la resta en segundo plano. En el panel de control del experimento, haga clic en Registrar datos para registrar los datos del experimento. En la sección Lapso de tiempo del panel de control, establezca el Intervalo de adquisición de datos en un segundo.
A continuación, haga clic en Reloj cero y adquisición en el panel de control del experimento para comenzar la adquisición de datos. Ahora aplique tratamientos a las células según los requisitos. Una vez completada la adquisición de datos, haga clic en Pausa para detener el proceso.
Guarde los datos adquiridos y proceda con el análisis. Para finalizar el experimento, haga clic en Archivo y seleccione Cerrar experimento. Finalmente, cierre el software y transfiera todos los datos guardados desde la computadora.
Los queratinocitos primarios cargados con la sonda Fura-2 mostraron una morfología celular visible a una longitud de onda de 380 nanómetros. La respuesta térmica de los queratinocitos mostró un aumento en la concentración de iones de calcio intracelular durante el calentamiento, con una respuesta similar observada durante el enfriamiento. La respuesta térmica fue abolida en los queratinocitos, careciendo del gen STIM1 que indica el papel del gen en la señalización térmica del calcio.
HEK293T células que sobreexpresan STIM1/Orai1 mostraron una respuesta térmica notable al enfriarse, lo que confirma el éxito de la expresión génica, como lo demuestran los marcadores de fluorescencia verde y roja. La respuesta de entrada de calcio operada por almacenamiento en las células que sobreexpresan STIM1-Orai1 fue inducida eficazmente por cambios secuenciales en la concentración de calcio extracelular y la emisión de ácido ciclopiazónico a través de la profusión. El pipeteo directo de capsaicina, un agonista de TRPV1, desencadenó la entrada de calcio extracelular en las células que expresan el plásmido TRPV1.
