Tomografía seriada de dos fotones de todo el cerebro del tití para análisis neuroanatómicos

Nuestra investigación explora la base estructural de las funciones cerebrales, incluidas las de los seres humanos. Utilizando el tití común como modelo, nuestro objetivo es comprender mejor el cerebro de los primates mediante la identificación de las conexiones neuronales que se comparten entre especies y aquellas que están fuera del género de primates. Realizamos un mapeo exhaustivo de las proyecciones prefrontales del cerebro del tití.

Utilizando la técnica de tomografía de dos fotones en serie, logramos una reconstrucción 3D de alta precisión de todo el cerebro, que reveló proyecciones columnares robustas entre las áreas de asociación. La tomografía seriada de dos fotones proporciona un conjunto de datos para comprender la conectividad neuronal a escala de todo el cerebro. Nuestro protocolo no solo ayuda a mejorar el procesamiento de los cerebros de los titíes, sino que también ofrece información sobre el manejo de otros especímenes.

Para empezar, tome el cerebro de tití aislado y fijo e incubarlo con colagenasa a 37 grados centígrados durante una hora. Con un hisopo de algodón, frote cuidadosamente la superficie del cerebro para despegar la piamadre y otras meninges. Use pinzas finas para extirpar las meninges desprendidas restantes.

Para preparar el tampón de borohidruro de sodio, disuelva 0,2 gramos de borohidruro de sodio en 100 mililitros de tampón de borato de 50 milimoles, precalentado a 40 grados centígrados. Prepare la agarosa oxidada revolviendo 2,25 gramos de agarosa y 0,21 gramos de periodato de sodio en 100 mililitros de tampón de fosfato durante dos o tres horas. Filtrar la solución mediante succión al vacío y lavarla con tres cambios de tampón de fosfato.

A continuación, vuelva a suspender la agarosa en 50 mililitros de tampón de fosfato. A continuación, derrita completamente la agarosa en un horno de microondas y deje que se enfríe a 60 a 65 grados centígrados. Coloque el cerebro en una cámara hecha a medida e incruste el cerebro en agarosa, asegurándose de que la agarosa llene la cavidad debajo del cuerpo calloso.

Después de la solidificación del gel de agarosa, desmonte la cámara y sumerja el bloque de agarosa en el tampón de borohidruro de sodio durante la noche a cuatro grados centígrados. Ahora, usando una mezcla instantánea de epoxi, construya una etapa de vidrio deslizante colocando cuatro imanes de neodimio. Monta el bloque de agarosa en el escenario con un adhesivo fuerte.

Opere todo el sistema de imágenes de tejidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Procesa todo el cerebro del tití coronalmente desde el extremo anterior hasta el posterior. Luego, ajuste los ángulos de la hoja para asegurarse de que las profundidades de la superficie en ambos extremos estén dentro de los 10 micrómetros.

Para hacer esto, busque la superficie superior cambiando la posición del objetivo, usando el controlador piezoeléctrico. Ajuste el plano de imagen a aproximadamente 25 a 35 micrómetros de la superficie para compensar la mielinización densa y garantizar una penetración uniforme del láser. Con una cuchilla de cerámica, corte todo el cerebro en intervalos de 50 micrómetros, produciendo aproximadamente 650 rebanadas.