Financement: Ce travail a été soutenu par un QG Stuart &amp; Victoria Quan Bourse prédoctorale (RVM), NIH Pioneer Award (RAS)

Examen médical général Un traitement plus complet des examens de santé général peuvent être trouvées dans Jacqueline Crawley ressources phénotypage excellente comportement, quel mal avec ma souris? 1. Nous utilisons d&#39;abord une batterie de tests modifiés d&#39;observation pour évaluer la santé générale du sujet. La batterie comprend des éléments de Samuel Irwin protocole d&#39;évaluation complète de 2 à identifier rapidement les sujets qui seront inappropriés pour des tests supplémentaires. En bref, la batterie modifiés identifie les animaux qui sont physiquement anormale (par exemple, fortement sous-ou sur-poids, mal entretenues, dyspnéique) ou qui présentent une posture anormale, la locomotion ou de comportements. Ces manifestations pourraient toutes être de la maladie. Toute évaluation initiale qui identifie pareillement sujets malsains est approprié. Il est également important de noter que les animaux sont utilisés à la fois humainement pendant l&#39;examen de santé général ainsi que lors des essais ultérieurs. Aucune anesthésie ou analgésie est utilisée comme ces tests ne tiennent pas compte des procédures potentiellement douloureuses. Test sensibilité olfactive Ce test est conçu pour détecter une différence de sensibilité olfactive entre deux groupes de souris (par exemple un type sauvage et un groupe de mutants d&#39;animaux). Dans ce test, les dilutions multiples d&#39;un parfum sont faites. Un animal naïf examine ensuite une dilution unique de ce parfum et le temps total d&#39;exploration (dans les 3 minutes) est enregistrée. Dilutions multiples du parfum sont testés sur différents sujets naïfs et le temps total d&#39;exploration est utilisé pour générer des courbes dose-réponse pour chaque groupe de souris. Deux chercheurs devraient être impliqués dans les tests, avec un aveugle à des génotypes sujet et / ou condition. Chercheur principal <ol><li> Obtenir quatre cages propres (8 H x 10 W x 18 L, en pouces), le tout sans literie. Alignez les quatre cages dans l&#39;enceinte de biosécurité. </li><li> Mettre en place des cloisons entre chaque scène en utilisant un papier filtre opaque. Placez une affiche noire à travers la partition finale tels que les lignes de côté en noir sur le côté et en bas de la cage. Couvrez le dessus de l&#39;arène avec un morceau de plexiglas clair pour permettre à la lumière pour éclairer la scène. (A) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="Figure 1" /> (B) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="Figure 1.5" /> Figure 1. Arena Set-Up. (A) convenablement habillé, arène vide (b) Arena avec un papier filtre sujet et parfumée. </li> <li> Commencez habituer les sujets. Placez le premier sujet dans la première cage d&#39;accoutumance. Après 15 minutes, passer le premier sujet à la deuxième cage. Nettoyez la cage d&#39;abord avec la tuberculose Quatricide. Ensuite, placer le sujet dans la première seconde, la cage nettoyée. Continuez ce processus avec les sujets suivants. En définitive, chaque sujet doit être habitués dans les trois cages avant d&#39;être placés dans l&#39;arène (cage quatrième et dernier) pour un autre 15 minutes d&#39;accoutumance avant les essais. </li></ol> Chercheur aveugles <ol><li> Faire un nombre approprié de 2 pouces par 2 pouces carrés de papier filtre pour les échantillons de parfum. </li><li> En utilisant le parfum de pré-sélectionnées, de manière appropriée de le diluer. Pour les échantillons hydrophobes tels que le beurre d&#39;arachide, utiliser le pétrole comme solvant; pour tous les autres, l&#39;utilisation de l&#39;eau distillée. Vortex. </li><li> Régler un dispositif d&#39;enregistrement vidéo numérique à l&#39;extrémité de l&#39;enceinte de sécurité biologique tels que la fin cage entière est au point. Prenez une vidéo préliminaires pour s&#39;assurer paramètres sont adéquats. </li><li> Enregistrement de l&#39;ordre dans lequel les dilutions seront testés, en prenant soin de randomiser l&#39;ordre des essais. </li><li> L&#39;objet Record litière et les numéros d&#39;identification. </li><li> Une fois que le sujet a été habituée pendant 15 minutes dans l&#39;arène, commencer la préparation pour le premier essai. Pipeter la première dilution de haut en bas dans le tube conique avant pipetage sur un carré de papier filtre. La surface du papier filtre doit être couvert de façon optimale ~ 85% (environ 0,50 ml de solution). Utilisez un Kimwipe pour s&#39;assurer que le papier filtre n&#39;est pas trop saturé. </li><li> Commencez l&#39;enregistrement vidéo. </li><li> Placer le carré de papier filtre dans la cage à l&#39;extrémité opposée de la position actuelle de l&#39;animal. </li><li> Commencer à chronométrer. </li><li> Après 3 minutes, arrêter l&#39;enregistrement et retirer le parfum diluée. </li><li> Si un seul parfum (ex: cannelle) doit être testé, retirer le sujet premier test de l&#39;arène. Répétez les étapes 6-11 pour chaque animal, de façon appropriée diluer le parfum pour chaque sujet. Si plus d&#39;un parfum est d&#39;être testé, cependant, ne retirez pas le sujet du test de l&#39;arène. Au lieu de cela, débuter le chronométrage. </li><li> Appropriée diluer le parfum de la prochaine utilisant les mêmes méthodes que ci-dessus. </li><li> Après 1 minute, commencer l&#39;enregistrement vidéo. Placer le carré de papier filtre avec la dilution du parfum suivante dans la cage à l&#39;extrémité opposée de la Positio actuelle de l&#39;animaln. </li><li> Répétez les étapes 6-13 pour chaque parfum, en notant le nombre de fichiers vidéo pour chaque essai. </li><li> Répétez les étapes 6-14 pour chaque sujet. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les résultats représentatifs pour une session de tests de sensibilité olfactive. Chaque souris soit du groupe contrôle (groupe A) ou le groupe expérimental (groupe B) a été exposé à l&#39;une des cinq différentes dilutions de l&#39;extrait de cannelle sur un papier filtre pour un, trois sessions minute. Le temps total passé à explorer le papier filtre a été évaluée. Souris dans le groupe A ont une plus grande sensibilité olfactive que ceux dans le groupe B. </li></ol> Test préférence olfactive Ce test est conçu pour identifier les lacunes de détection spécifique, à savoir la capacité de sentir les parfums attrayant ou aversif. La procédure suivante s&#39;inspire largement du protocole de Kobayakawa, K., et al.3. Encore une fois, deux chercheurs devraient être impliqués dans les tests, avec un aveugle à des génotypes sujet et / ou condition. Le temps total d&#39;exploration est de nouveau enregistré (à la vue vidéo) pour des parfums différents. Ceux parfums avec un total de fois plus grande que l&#39;eau exploratoires sont désignés comme &quot;attractifs&quot;, tandis que ceux avec des temps de moins que l&#39;eau sont appelées «aversif». Le chercheur se demande ensuite si les senteurs mêmes sont «attractifs» ou «aversion» pour des sujets de test différents. S&#39;il vous plaît suivez les étapes 1-3 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur principal. Chercheur aveugles La procédure de tests olfactifs préférences est la même, avec de légères modifications des étapes 2 et 4. S&#39;il vous plaît suivez les étapes 1 à 15 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur aveugle, avec les modifications suivantes: Pour l&#39;étape 2, en utilisant les senteurs pré-sélectionnés (une combinaison de senteurs à la fois attrayant et aversif), rendre les solutions diluée de façon appropriée de chacun dans tubes coniques. Pour les échantillons hydrophobes tels que le beurre d&#39;arachide, utiliser le pétrole comme solvant; pour tous les autres, l&#39;utilisation de l&#39;eau distillée. Vortex. Pour l&#39;étape 4, plutôt que l&#39;enregistrement de la dilution à tester, d&#39;enregistrer l&#39;ordre des senteurs variées qui seront testés, aléatoire l&#39;ordre des essais. Ce test est conçu pour identifier les lacunes de détection spécifique, à savoir la capacité de sentir les parfums attrayant ou aversif. La procédure suivante s&#39;inspire largement du protocole de Kobayakawa, K. et al. 3. Encore une fois, deux chercheurs devraient être impliqués dans les tests, avec un aveugle à des génotypes sujet et / ou condition. Le temps total d&#39;exploration est de nouveau enregistré (à la vue vidéo) pour des parfums différents. Ceux parfums avec un total de fois plus grande que l&#39;eau exploratoires sont désignés comme &quot;attractifs&quot;, tandis que ceux avec des temps de moins que l&#39;eau sont appelées «aversif». Le chercheur se demande ensuite si les senteurs mêmes sont «attractifs» ou «aversion» pour des sujets de test différents. S&#39;il vous plaît suivez les étapes 1-3 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur principal. Chercheur aveugles La procédure de tests olfactifs préférences est la même, avec de légères modifications des étapes 2, 4 et 13. S&#39;il vous plaît suivez les étapes 1 à 15 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur aveugle, avec les modifications suivantes: Pour l&#39;étape 2, en utilisant les senteurs pré-sélectionnés (une combinaison de senteurs à la fois attrayant et aversif), rendre les solutions diluée de façon appropriée de chacun dans tubes coniques. Pour les échantillons hydrophobes tels que le beurre d&#39;arachide, utiliser le pétrole comme solvant; pour tous les autres, l&#39;utilisation de l&#39;eau distillée. Vortex. Pour l&#39;étape 4, plutôt que l&#39;enregistrement de la dilution à tester, d&#39;enregistrer l&#39;ordre des senteurs variées qui seront testés, la randomisation de l&#39;ordre dans chaque essai. Pour l&#39;étape 13, place du carré de papier filtre avec le parfum suivant dans la cage à l&#39;extrémité opposée de la position actuelle de l&#39;animal. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="Figure 3" /> Figure 3. Les résultats représentatifs pour une session de tests de préférences olfactives. Chaque souris a été exposé à chacune des différentes senteurs sur papier filtre pour un, trois sessions minute. Le temps total passé à explorer le papier filtre a été évaluée. Le beurre d&#39;arachide et la vanille sont attrayants parfums (parfum du temps exploratoires&gt; l&#39;eau le temps d&#39;exploration) et 2-méthylbutyrique est aversif (parfum du temps exploratoires &lt;l&#39;eau de temps exploratoire). Notation des tests olfactifs Après l&#39;acquisition de toutes les sensibilité olfactive et vidéos préférence, il est nécessaire d&#39;analyser le temps total passé à explorer chaque dilution / parfum. Avez-aveugle, le chercheur d&#39;analyser l&#39;ensemble des vidéos pour la cohérence. <ol><li> Aperçu de la video, notant les points suivants: a) lorsque le papier filtre est placé dans l&#39;arène, b) lorsque la souris s&#39;approche du papier filtre, c) lorsque la souris enquête sur le papier filtre et d) lorsque trois minutes sont écoulées (à partir lorsque le filtre document a été placé dans l&#39;arène). Savoir quand se concentrer sur le comportement de la souris, il est plus facile de précision le score du temps total passé à explorer après examen. </li><li> Revue de la vidéo. Noter le temps quand la souris étudie d&#39;abord le papier filtre (latence). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un chronomètre, le temps de toutes les enquêtes dans les trois minutes de placer le papier filtre dans l&#39;arène. Le moment de l&#39;enquête est défini comme n&#39;importe quel moment lors des narines de la souris sont &lt;1 mm du papier filtre. Il est important de ne pas inclure tout le temps lorsque la souris est à proximité du papier filtre, mais il n&#39;est pas activement d&#39;instruction. Ne pas inclure les épisodes de la mastication et de lécher le papier ou des épisodes de s&#39;asseoir sur le papier dans le temps total d&#39;exploration. Il est nécessaire d&#39;adhérer étroitement et régulièrement à ces règles afin d&#39;analyser précisément le comportement olfactif. </li><li> Temps de latence d&#39;enregistrement, le temps total consacré aux enquêtes du papier filtre et le numéro de fichier vidéo. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

Les tests susmentionnés permettre l&#39;évaluation rapide et fiable de la fonction olfactive de base. Il n&#39;est pas à négliger, toutefois, que cette fiabilité exige la sélection et la préparation des sujets pour les essais. Les animaux qui sont malades ou incapables sont souvent des sujets de test incompatibles. En outre, l&#39;habituation des sujets du test est la clé. Nous avons constaté que l&#39;utilisation de cages multiples au cours du processus d&#39;habituation permet aux animaux de se familiariser a...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

Le système olfactif est de rongeurs d&#39;un intérêt croissant pour les scientifiques, ont étudié, en partie, dans la biologie des systèmes en raison de sa stéréotypés, des circuits encore accessibles. En outre, la capacité unique de cette région à générer de nouveaux neurones tout au long vie d&#39;un organisme en fait un système attractif pour les biologistes du développement et de régénération semblables. Ces intérêts nécessite des moyens pour une évaluation rapide, et fiable de la fonction olfactive. De nombreux tests de la capacité olfactive est complexe, variable ou non spécifiquement conçus pour les souris. En outre, certains tests sont sensibles aux déficits de la mémoire ainsi que des défauts dans les capacités olfactives, confondant les résultats obtenus. Ici, nous décrivons une simple pile de tests conçus pour identifier les défauts de la sensibilité olfactive et la préférence. Tout d&#39;abord, une évaluation de la santé générale initiale permet l&#39;identification des animaux appropriés pour des tests supplémentaires. Deuxièmement, les souris sont exposées à différentes dilutions de parfums pour vérifier si il ya une différence de seuil. Troisièmement, les souris sont présentés avec des parfums différents, à la fois attrayant et aversifs, qui permettent l&#39;évaluation de la préférence olfactive. Ces études devraient faire simple, la caractérisation initiale du comportement olfactif accessibles pour les laboratoires des ressources et des compétences diversifiées.

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Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Fondamentaux, propriétés encore unique du système olfactif des rongeurs ont conduit à son étude augmente chez les biologistes. Une évaluation relativement simple de sa fonction est alors également nécessaire. Nous décrivons ici les tests sensibles pour la caractérisation de la sensibilité olfactive et la souris de préférence.

Olfactive tests comportementaux chez la souris adulte

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K vues.  Dana Farber Cancer Institute. Fondamentaux, propriétés encore unique du système olfactif des rongeurs ont conduit à son étude augmente chez les biologistes. Une évaluation relativement simple de sa fonction est alors également nécessaire. Nous décrivons ici les tests sensibles pour la caractérisation de la sensibilité olfactive et la souris de préférence.

Vidéo: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Recherche

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage poisson zèbre pour adultes

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolement des cellules gliales entériques de la sous-muqueuse et de la Lamina Propria de la souris adulte

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolement, caractérisation et différenciation des cellules souches cardiaques du coeur de souris adulte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...