Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da un HQ Stuart &amp; Victoria Fellowship Quan Predoctoral (RMW), NIH premio Pioneer (RAS)

Generale Sanità esame Un trattamento più completo degli esami di salute generale può essere trovato in risorsa eccellente Jacqueline Crawley fenotipo comportamentale, Cosa c&#39;è di sbagliato con il mio mouse? 1. Per prima cosa utilizzare una batteria modificata prova osservazionale per valutare la salute generale del soggetto. La batteria comprende elementi dal protocollo completo di Samuel Irwin valutazione 2 per identificare rapidamente quei soggetti che saranno adatti per ulteriori test. In breve, la batteria modificata identifica gli animali che sono fisicamente anormali (es. gravemente sotto-o sovra-peso, mal curato, dispnea) o che presentano anomalie postura, locomozione o comportamenti. Tutti questi possono essere manifestazioni della malattia. Qualsiasi valutazione iniziale che identifica in modo simile soggetti malsana è appropriato. E &#39;anche importante notare che gli animali sono utilizzati umanamente sia durante l&#39;esame di salute generale, così come durante i test successivi. Nessuna anestesia o analgesia viene utilizzato come tali esami non incorporano alcuna procedura potenzialmente dolorosa. Sensibilità test olfattivo Questo test è progettato per rilevare una differenza di sensibilità olfattiva tra due gruppi di topi (es. un wild-type e un gruppo di animali mutanti). In questo test, diluizioni più di un profumo sono fatti. Un animale ingenuo indaga poi una sola diluizione di questo profumo e il tempo totale esplorativa (entro 3 minuti) viene registrato. Diluizioni multiple del profumo sono testati su differenti, soggetti naïve e il tempo totale esplorativa viene utilizzato per generare le curve dose-risposta per ogni gruppo di topi. Due ricercatori dovrebbero essere coinvolti nei test, con una cieca genotipi soggetto e / o condizione. Ricercatore principale <ol><li> Ottenere quattro gabbie pulite (8 x 10 W x 18 L, in pollici), il tutto senza biancheria da letto. Allineare i quattro gabbie nell&#39;armadio biosicurezza. </li><li> Impostare le partizioni tra ogni arena utilizzando opaca carta da filtro. Posizionare un bordo nero manifesto tutta la partizione finale in modo tale che le linee laterali nere laterali e fondo della gabbia. Coprire la parte superiore dell&#39;arena con un pezzo di plexiglass trasparente per permettere alla luce di illuminare l&#39;arena. (A) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="Figura 1" /> (B) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Arena Set-Up. (A) conoscenza drappeggiato, arena vuota (b) Arena con soggetto e profumata carta da filtro. </li> <li> Iniziare abituare i soggetti. Posizionare il primo soggetto nella gabbia prima assuefazione. Dopo 15 minuti, passare il primo soggetto alla gabbia secondo. Pulire la gabbia prima con TB Quatricide. Successivamente, posto il secondo soggetto nella prima, gabbia pulita. Continuare questo processo con i soggetti successive. In definitiva, ogni soggetto deve essere abituati a tutte e tre le gabbie prima di essere immessi nell&#39;arena (gabbia quarta e finale) per altri 15 minuti di assuefazione prima del test. </li></ol> Ricercatore cieco <ol><li> Effettuare un numero adeguato di 2 pollici da 2 pollici quadrati di carta da filtro per i campioni di profumo. </li><li> Utilizzando il pre-selezionati profumo, opportunamente diluirlo. Per i campioni idrofobo come il burro di arachidi, usare il petrolio come solvente, per tutti gli altri, usare acqua distillata. Vortex. </li><li> Impostare un dispositivo di registrazione video digitale in fondo dell&#39;armadio biosicurezza tale che l&#39;estremità gabbia tutto è a fuoco. Prendete un video preliminare per garantire i parametri sono adeguati. </li><li> Registrare l&#39;ordine in cui diluizioni sarà testato, avendo cura di casuale l&#39;ordine delle prove. </li><li> Soggetto record rifiuti e numeri di identificazione. </li><li> Una volta che il soggetto è stato abituato per 15 minuti in campo, iniziare la preparazione per la prima prova. Pipetta prima diluizione su e giù nel tubo conico prima pipettaggio che su una piazza carta da filtro. La superficie del filtro di carta in modo ottimale dovrebbe essere coperto ~ 85% (circa 0,50 ml di soluzione). Utilizzare un kimwipe per assicurarsi che la carta da filtro non è eccessivamente saturo. </li><li> Iniziare la registrazione video. </li><li> Posizionare la piazza filtro di carta nella gabbia sul lato opposto della posizione attuale dell&#39;animale. </li><li> Iniziare il cronometraggio. </li><li> Dopo 3 minuti, interrompere la registrazione e rimuovere il profumo diluito. </li><li> Se solo un profumo (ad esempio la cannella) è da verificare, rimuovere il primo soggetto di test dall&#39;arena. Ripetere i passaggi 6-11 per ogni animale, diluendo opportunamente il profumo per ogni soggetto. Se più di un profumo è da verificare, tuttavia, non rimuovere il soggetto prova dall&#39;arena. Invece, iniziare il cronometraggio. </li><li> Opportunamente diluire il profumo successiva utilizzando gli stessi metodi sopra elencati. </li><li> Dopo 1 minuto, iniziare la registrazione video. Posizionare la piazza filtro di carta con la diluizione del profumo successivo nella gabbia sul lato opposto della positio attuale dell&#39;animalen. </li><li> Ripetere i passaggi 6-13 per ogni profumo, notando il numero di file video per ogni prova. </li><li> Ripetere i passaggi 6-14 per ogni soggetto. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risultati rappresentativi per una sessione di test di sensibilità olfattiva. Ogni topo sia dal gruppo di controllo (gruppo A) o il gruppo sperimentale (Gruppo B) è stata esposta a una delle cinque diverse diluizioni di estratto di cannella su carta da filtro per uno, tre minuti di sessione. Tempo totale di esplorare la carta da filtro è stata valutata. I topi del gruppo A hanno una maggiore sensibilità olfattiva di quelli del gruppo B. </li></ol> Preferenza test olfattivo Questo test è progettato per identificare carenze di rilevazione specifica, cioè la capacità di percepire i profumi attraenti o avversione. La procedura che segue prende in prestito liberamente dal protocollo di Kobayakawa, K., et al.3. Ancora una volta, due ricercatori dovrebbero essere coinvolti nei test, con una cieca genotipi soggetto e / o condizione. Il tempo totale esplorativa è ancora una volta registrato (su visualizzazione video) per profumi diversi. Quei profumi con totale esplorative volte maggiore di acqua sono designati come &quot;attraente&quot;, mentre quelli con volte meno acqua sono definiti &quot;avversione&quot;. Il ricercatore si chiede poi se gli stessi profumi sono &quot;attraenti&quot; o &quot;avversione&quot; per i soggetti di prova differenti. Si prega di seguire i passaggi 1-3 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore principale. Ricercatore non vedenti La procedura per il collaudo preferenza olfattiva è la stessa, con lievi modifiche di passi 2 e 4. Si prega di seguire i passaggi 1-15 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore non vedenti, con le seguenti modifiche: Per il punto 2, usando il pre-selezionato profumi (una combinazione di profumi attraenti e avversione), fanno soluzioni opportunamente diluite di ciascuno in tubi conici. Per i campioni idrofobo come il burro di arachidi, usare il petrolio come solvente, per tutti gli altri, usare acqua distillata. Vortex. Per il punto 4, invece di registrare la diluizione da testare, registrare l&#39;ordine dei profumi vario che sarà testato, randomizzare l&#39;ordine delle prove. Questo test è progettato per identificare carenze di rilevazione specifica, cioè la capacità di percepire i profumi attraenti o avversione. La procedura che segue prende in prestito liberamente dal protocollo di Kobayakawa, K. et al. 3. Ancora una volta, due ricercatori dovrebbero essere coinvolti nei test, con una cieca genotipi soggetto e / o condizione. Il tempo totale esplorativa è ancora una volta registrato (su visualizzazione video) per profumi diversi. Quei profumi con totale esplorative volte maggiore di acqua sono designati come &quot;attraente&quot;, mentre quelle con volte meno acqua sono definiti &quot;avversione&quot;. Il ricercatore si chiede poi se gli stessi profumi sono &quot;attraenti&quot; o &quot;avversione&quot; per i soggetti di prova differenti. Si prega di seguire i passaggi 1-3 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore principale. Ricercatore non vedenti La procedura per il collaudo preferenza olfattiva è la stessa, con lievi modifiche di punti 2, 4 e 13. Si prega di seguire i passaggi 1-15 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore non vedenti, con le seguenti modifiche: Per il punto 2, usando il pre-selezionato profumi (una combinazione di profumi attraenti e avversione), fanno soluzioni opportunamente diluite di ciascuno in tubi conici. Per i campioni idrofobo come il burro di arachidi, usare il petrolio come solvente, per tutti gli altri, usare acqua distillata. Vortex. Per il punto 4, invece di registrare la diluizione da testare, registrare l&#39;ordine dei profumi vario che sarà testato, randomizzare l&#39;ordine in ogni prova. Per il passaggio 13, posto sulla piazza filtro di carta con il profumo successivo nella gabbia sul lato opposto della posizione attuale dell&#39;animale. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="Figura 3" /> Figura 3. Risultati rappresentativi per una sessione di test olfattivi preferenza. Ogni mouse è stato esposto a ciascuno dei diversi profumi su carta da filtro per uno, tre minuti di sessione. Tempo totale di esplorare la carta da filtro è stata valutata. Burro di arachidi e vaniglia sono profumi attraenti (profumo esplorativa volta&gt; acqua momento esplorativo) e 2-Methylbutyric acido è avversivo (profumo esplorativa volta &lt;acqua momento esplorativo). Punteggio del test olfattivo Dopo aver acquisito tutte le sensibilità olfattiva e video preferenza, è necessario analizzare il tempo totale trascorso esplorando ogni diluizione / profumo. Hanno il ricercatore cieco analizzare tutti i video di coerenza. <ol><li> Anteprima del video, rilevando quanto segue: a) quando la carta da filtro è posto in campo, b) quando il mouse si avvicina la carta da filtro, c) quando il mouse indaga la carta da filtro e d) quando i minuti sono trascorsi tre (da quando il filtro la carta è stata posta in campo). Sapere quando di concentrarsi sul comportamento del mouse, rende più facile segnare con precisione il tempo totale trascorso su di esplorare recensione. </li><li> Rivedere il video. Si noti il ​​momento in cui il mouse indaga il primo filtro di carta (latenza). </li><li> Utilizzando un cronometro, tempo tutte le indagini entro tre minuti di mettere la carta da filtro nell&#39;arena. Il tempo di ricerca è definito come qualsiasi periodo in cui narici del mouse sono &lt;1 mm dalla carta da filtro. È importante non includere qualsiasi parte del tempo quando il mouse si trova in prossimità della carta da filtro, ma non è attivamente indagando. Non includere attacchi di masticare e leccare la carta o attacchi di seduta sulla carta nel tempo totale esplorativa. E &#39;necessario attenersi strettamente e coerentemente a queste regole di analizzare con precisione il comportamento olfattivo. </li><li> Latenza tempo di record, il tempo totale trascorso indagando il filtro con il numero di file video. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

I test di cui sopra consentire la valutazione rapida e affidabile di base funzione olfattiva. Non è da trascurare, tuttavia, che questo richiede affidabilità la selezione e la preparazione di soggetti per il test. Gli animali malati o comunque inabili sono spesso soggetti dei test incoerente. Inoltre, l&#39;abitudine dei soggetti testati è la chiave. Abbiamo trovato che l&#39;uso di gabbie multiple durante il processo di assuefazione permette agli animali per familiarizzare con la manipolazione sperimentatore e cambi...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

Il sistema olfattivo dei roditori è di crescente interesse per gli scienziati, ha studiato, in parte, alla biologia dei sistemi a causa della sua stereotipata, circuiti ancora accessibile. Inoltre, la capacità unica di questa zona di generare nuovi neuroni per tutta la vita di un organismo rende un sistema interessante per i biologi dello sviluppo e rigenerante allo stesso modo. Tale interesse richiede un mezzo per una rapida valutazione, ma affidabile della funzione olfattiva. Molti test di capacità olfattive sono complesse, variabili o non specificamente progettati per i topi. Inoltre, alcuni test sono sensibili al deficit di memoria e difetti di abilità olfattiva, confondendo risultati ottenuti. Qui, descriviamo una semplice batteria di test volti a identificare i difetti della sensibilità olfattiva e di preferenza. In primo luogo, un primo bilancio di salute generale consente l&#39;identificazione degli animali adatti per ulteriori test. In secondo luogo, i topi sono esposti a diluizioni diverse di profumi per accertare se c&#39;è una differenza di soglia. In terzo luogo, i topi sono presentati con profumi diversi, sia attraente e avversione, che consentono la valutazione di preferenza olfattiva. Questi studi dovrebbero rendere semplice la prima caratterizzazione di comportamento olfattivo accessibile per i laboratori di risorse e competenze diverse.

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Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Fondamentali, le proprietà ancora unica del sistema olfattivo dei roditori hanno portato al suo studio in aumento tra i biologi. Una valutazione relativamente semplice della sua funzione è poi anche necessario. Qui si descrive test sensibili per la caratterizzazione della sensibilità del mouse olfattivo e preferenza.

Olfattivo test comportamentali nel topo adulto

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  Dana Farber Cancer Institute. Fondamentali, le proprietà ancora unica del sistema olfattivo dei roditori hanno portato al suo studio in aumento tra i biologi. Una valutazione relativamente semplice della sua funzione è poi anche necessario. Qui si descrive test sensibili per la caratterizzazione della sensibilità del mouse olfattivo e preferenza.

Video: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Ricerca

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...