Financiamento: Este trabalho foi financiado por uma HQ &amp; Stuart Fellowship Victoria Quan Predoctoral (FMR), Prêmio NIH Pioneer (RAS)

Exame Geral de Saúde Um tratamento mais abrangente dos exames de saúde geral podem ser encontradas em Crawley recurso Jacqueline de fenotipagem excelente comportamento, que há de errado com o meu mouse? 1. Primeiro, use uma bateria de testes modificados observacional para avaliar a saúde geral do assunto. A bateria inclui itens do protocolo de Samuel Irwin avaliação abrangente de 2 a identificar rapidamente os assuntos que serão inadequados para testes adicionais. Em breve, a bateria modificada identifica os animais que são fisicamente anormais (por exemplo severamente sub ou excesso de peso, mal preparado, dispnéico) ou que apresentam postura anormal de locomoção, ou comportamentos. Estes todos poderiam ser manifestações da doença. Qualquer avaliação inicial que identifica de forma semelhante assuntos insalubre é apropriado. Também é importante notar que os animais são usados ​​de forma humana, tanto durante o exame de saúde geral, bem como durante os testes subseqüentes. Sem anestesia ou analgesia é usado como estes testes não incorporam quaisquer procedimentos potencialmente dolorosos. Teste de Sensibilidade olfativa Este teste foi concebido para detectar uma diferença de sensibilidade olfativa entre dois grupos de camundongos (por exemplo, digite um selvagem e um grupo mutante de animais). Neste teste, diluições múltiplas de um perfume são feitas. Um animal de ingênua, em seguida, investiga uma diluição única de este perfume eo tempo total de exploração (dentro de 3 minutos) é registrado. Diluições múltiplas do perfume são testados em diferentes, os indivíduos ingênuos e do tempo total exploratória é usada para gerar curvas de dose-resposta para cada grupo de camundongos. Dois pesquisadores devem ser envolvidos nos testes, com um cego para genótipos assunto e / ou condição. Pesquisador principal <ol><li> Obter quatro gaiolas limpas (8 H x 10 W x 18 L, em polegadas), todas sem fundamento. Alinhe os quatro gaiolas no gabinete de biossegurança. </li><li> Configurar partições entre cada arena usando filtro de papel opaco. Coloque um cartaz em preto em toda a partição final de tal forma que as linhas laterais pretas ao lado e fundo da gaiola. Cobrir a parte superior da arena com um pedaço transparente de acrílico para permitir a luz para iluminar a arena. (A) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="Figura 1" /> (B) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Arena Set-Up. (A) adequadamente coberto arena, vazia (b) Arena com o assunto e perfumado papel de filtro. </li> <li> Começar a habituar os indivíduos. Colocar o assunto em primeiro lugar na primeira gaiola de habituação. Após 15 minutos, mova o primeiro tópico da segunda gaiola. Limpar a gaiola primeiro com TB Quatricide. Em seguida, coloque o assunto em segundo lugar na gaiola, primeiro limpa. Continue esse processo com assuntos subseqüentes. Em última análise, cada indivíduo deve ser habituado em todas as três gaiolas antes de serem colocados na arena (gaiola quarto e último) por mais 15 minutos de habituação antes do teste. </li></ol> Pesquisador cego <ol><li> Faça um número apropriado de 2 polegadas por 2 polegadas quadrados de papel de filtro para amostras perfume. </li><li> Usando o perfume pré-selecionados, devidamente diluir. Para amostras hidrofóbicas, tais como manteiga de amendoim, usar o petróleo como solvente; para todos os outros, use água destilada. Vortex. </li><li> Definir um dispositivo de gravação digital de vídeo na extremidade do gabinete de segurança biológica de tal forma que o fim gaiola inteira está em foco. Tome um vídeo preliminar para assegurar os parâmetros são adequados. </li><li> Gravar a ordem em que serão testadas diluições, tomando cuidado para randomizar a ordem dos julgamentos. </li><li> Ninhada registro assunto e números de identificação. </li><li> Uma vez que o assunto tem sido habituados por 15 minutos na arena, começar a preparação para o primeiro julgamento. Pipeta primeira diluição cima e para baixo no tubo cônico antes de pipetar-lo para um quadrado de papel de filtro. A superfície do papel filtro deve ser otimizada cobertos ~ 85% (cerca de 0,50 ml de solução). Use uma kimwipe para certificar-se do papel de filtro não é muito saturado. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo. </li><li> Coloque o quadrado de papel de filtro na gaiola no lado oposto da posição atual do animal. </li><li> Começar a cronometragem. </li><li> Após 3 minutos, parar a gravação e remover o cheiro diluído. </li><li> Se apenas um aroma (por exemplo, canela) está a ser testado, remova o assunto primeiro teste da arena. Repita os passos 6-11 para cada animal, devidamente diluir o perfume para cada assunto. Se mais de um perfume deve ser testado, no entanto, não remova o assunto de teste da arena. Em vez disso, começar a cronometragem. </li><li> Apropriadamente diluir o cheiro seguinte usando os mesmos métodos listados acima. </li><li> Após 1 minuto, iniciar a gravação de vídeo. Coloque o quadrado de papel de filtro com a diluição do cheiro próximo a gaiola na extremidade oposta da positio atual do animaln. </li><li> Repita os passos 6-13 para cada perfume, observando o número de arquivos de vídeo para cada julgamento. </li><li> Repita os passos 6-14 para cada assunto. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultados representativos para uma sessão de testes de sensibilidade olfativa. Cada rato tanto do grupo controle (Grupo A) ou o grupo experimental (Grupo B) foi exposto a um dos cinco diferentes diluições de extrato de canela em papel de filtro para uma sessão minuto, três. Tempo total gasto explorando o papel de filtro foi avaliada. Ratos do grupo A têm uma maior sensibilidade olfativa do que os do Grupo B. </li></ol> Teste de Preferência olfativa Este teste foi concebido para identificar as deficiências específicas de detecção, ou seja, a capacidade de sentir cheiros atraentes ou aversivo. O procedimento a seguir toma emprestado livremente a partir do protocolo de Kobayakawa, K., et al.3. Novamente, dois pesquisadores devem ser envolvidos nos testes, com um cego para genótipos assunto e / ou condição. O tempo total exploratória é novamente gravado (em cima da visão de vídeo) para diversos aromas. Aqueles perfumes com um total de vezes maior do que a água exploratória são designados como &quot;atraente&quot;, enquanto aqueles com menos de água vezes são chamadas de &quot;aversão&quot;. O pesquisador então se considera os perfumes são mesmo &quot;atraente&quot; ou &quot;aversão&quot; para assuntos de teste diferente. Por favor, siga os passos 1-3 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador principal. Pesquisador cego O procedimento para o teste de preferência olfativa é o mesmo, com ligeiras modificações das etapas 2 e 4. Por favor, siga os passos 1-15 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador cego, com as seguintes alterações: Para a etapa 2, usando os aromas pré-selecionadas (uma combinação de aromas atraentes e aversivo), tornam as soluções adequadamente diluída de cada um em tubos cônicos. Para amostras hidrofóbicas, tais como manteiga de amendoim, usar o petróleo como solvente; para todos os outros, use água destilada. Vortex. Para a etapa 4, ao invés de gravar a diluição a ser testada, gravar a ordem dos aromas variados que serão testados, randomizing a ordem dos julgamentos. Este teste foi concebido para identificar as deficiências específicas de detecção, ou seja, a capacidade de sentir cheiros atraentes ou aversivo. O procedimento a seguir toma emprestado livremente a partir do protocolo de Kobayakawa, K. et al. 3. Novamente, dois pesquisadores devem ser envolvidos nos testes, com um cego para genótipos assunto e / ou condição. O tempo total exploratória é novamente gravado (em cima da visão de vídeo) para diversos aromas. Aqueles perfumes com um total de vezes maior do que a água exploratória são designados como &quot;atraente&quot;, enquanto aqueles com menos de água vezes são chamadas de &quot;aversão&quot;. O pesquisador então se considera os perfumes são mesmo &quot;atraente&quot; ou &quot;aversão&quot; para assuntos de teste diferente. Por favor, siga os passos 1-3 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador principal. Pesquisador cego O procedimento para o teste de preferência olfativa é a mesma, com pequenas modificações de passos 2, 4 e 13. Por favor, siga os passos 1-15 na Seção de Teste de Sensibilidade olfativa para o pesquisador cego, com as seguintes alterações: Para a etapa 2, usando os aromas pré-selecionadas (uma combinação de aromas atraentes e aversivo), tornam as soluções adequadamente diluída de cada um em tubos cônicos. Para amostras hidrofóbicas, tais como manteiga de amendoim, usar o petróleo como solvente; para todos os outros, use água destilada. Vortex. Para a etapa 4, ao invés de gravar a diluição a ser testada, gravar a ordem dos aromas variados que serão testados, randomizing a ordem em cada tentativa. Para a etapa 13, colocar o quadrado de papel de filtro com o cheiro próximo a gaiola no lado oposto da posição atual do animal. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados representativos para uma sessão de testes de preferência olfativa. Cada rato foi exposto a cada um dos diferentes aromas em papel de filtro para uma sessão minuto, três. Tempo total gasto explorando o papel de filtro foi avaliada. Manteiga de amendoim e baunilha são aromas atraentes (scent tempo exploratória&gt; água tempo exploratório) e 2-Methylbutyric ácido é aversivo (scent tempo exploratória &lt;água tempo exploratório). Pontuação dos Testes Olfactory Depois de adquirir todos os sensibilidade olfativa e vídeos de preferência, é necessário analisar o tempo total gasto explorando cada diluição / perfume. Têm o pesquisador cego analisar todos os vídeos para a consistência. <ol><li> Visualizar a video, observando o seguinte: a) quando o papel filtro é colocado na arena, b) quando o mouse se aproxima do papel de filtro, c) quando o mouse investiga o papel de filtro e d) quando tenham decorrido três minutos (a partir de quando o filtro papel foi colocado na arena). Saber quando o foco sobre o comportamento do rato torna mais fácil com precisão a pontuação do tempo total gasto explorando após a revisão. </li><li> Rever o vídeo. Observe o momento em que o primeiro rato investiga o papel de filtro (latência). </li><li> Usando um cronômetro o tempo, todas as investigações dentro de três minutos de colocar o papel de filtro na arena. O tempo de investigação é definido como qualquer momento em que o mouse narinas são &lt;1 mm a partir do papel de filtro. É importante não incluir qualquer parte do tempo quando o mouse está em estreita proximidade com o papel de filtro, mas não é ativamente investigando o caso. Não incluem surtos de mastigação e lambendo o papel ou surtos de sentar-se sobre o papel no tempo total de exploração. É necessário aderir de perto e de forma consistente com estas regras com precisão analisar o comportamento olfativo. </li><li> Tempo de latência Record, o tempo total gasto investigando o papel de filtro e número de arquivo de vídeo. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

Os testes citados permitem a avaliação rápida e confiável da função olfativa básica. Não é para ser esquecido, no entanto, que essa confiabilidade requer a seleção adequada e preparação de temas para o teste. Animais que estão doentes ou incapacitados são muitas vezes assuntos de teste inconsistentes. Além disso, a habituação dos assuntos de teste é fundamental. Descobrimos que o uso de gaiolas múltiplas durante o processo de habituação permite que os animais se sentem confortáveis ​​com exper...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

O sistema olfativo dos roedores é de crescente interesse para os cientistas, estudou, em parte, em biologia de sistemas por causa do seu circuito, estereotipada, porém acessível. Além disso, a capacidade única desta área para gerar novos neurônios ao longo da vida de um organismo faz com que seja um sistema atraente para os biólogos do desenvolvimento e regenerativos semelhantes. Tal interesse exige um meio para uma avaliação rápida, mas confiável da função olfativa. Muitos testes de capacidade olfativa é complexa, variável ou não projetados especificamente para ratos. Além disso, alguns testes são sensíveis a déficits de memória, bem como defeitos na capacidade olfativa, confundindo resultados obtidos. Aqui, descrevemos uma simples bateria de testes para identificar defeitos na sensibilidade olfativa e preferência. Primeiro, uma avaliação da saúde geral inicial permite a identificação de animais adequados para testes adicionais. Segundo, os ratos são expostos a várias diluições de aromas para verificar se há uma diferença de limiar. Em terceiro lugar, os camundongos são apresentados com aromas diversos, atraente e aversivo, que permitem a avaliação de preferência olfativa. Estes estudos simples deve fazer a primeira caracterização do comportamento olfativo acessíveis para laboratórios de recursos variados e expertise.

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Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Fundamentais, ainda propriedades únicas do sistema olfativo dos roedores, levaram ao seu estudo crescente entre os biólogos. A avaliação relativamente simples de sua função é, então, também é necessário. Aqui nós descrevemos testes sensíveis para a caracterização da sensibilidade olfativa do mouse e preferência.

Teste Comportamental olfativo no rato adulto

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K visualizações.  Dana Farber Cancer Institute. Fundamentais, ainda propriedades únicas do sistema olfativo dos roedores, levaram ao seu estudo crescente entre os biólogos. A avaliação relativamente simples de sua função é, então, também é necessário. Aqui nós descrevemos testes sensíveis para a caracterização da sensibilidade olfativa do mouse e preferência.

Vídeo: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Biologia

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-interno pilha injeção maciça de células-tronco embrionárias leva a taxas mais elevadas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...