Finansman: Bu çalışma, Stuart HQ &amp; Victoria Quan predoctoral Bursu (RMW), NIH Pioneer Ödülü (RAS) tarafından desteklenen

Genel Sağlık Sınavı Genel sağlık muayeneleri daha kapsamlı bir tedavi Jacqueline Crawley mükemmel davranış fenotipleme kaynak bulunabilir, ne benim Mouse ile yanlış? 1. Önce, konunun genel sağlık değerlendirmek için modifiye edilmiş bir gözlemsel test bataryası kullanın. Pil daha fazla test için uygun olacak bu konuları hızlı bir şekilde tanımlamak için Samuel Irwin kapsamlı bir değerlendirme protokolü 2 öğeler içerir. Kısacası, modifiye pil fiziksel anormal hayvanlar tanımlar (örneğin, ciddi ya da aşırı kilo, kötü bakımlı, dyspneic) ya da bu sergi anormal postür, hareket veya davranışları. Bunların hepsi hastalık belirtileri olabilir. Sağlıksız konularda benzer tanımlar herhangi bir başlangıç ​​değerlendirmesi uygun olur. Hayvanların yanı sıra, sonraki testler sırasında genel sağlık muayenesi sırasında insanca hem de kullanılmakta olduğunu da not etmek önemlidir. Bu testlerin herhangi bir potansiyel ağrılı işlemler dahil gibi, herhangi bir anestezi veya analjezi kullanılır. Olfaktör Duyarlılık Testi Bu test, iki grup arasında (örneğin bir yabani tip ve mutant hayvanlar grubu) farelerin koku alma hassasiyeti bir fark tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu testte, bir kokusu birden fazla dilüsyonları yapılır. Naif bir hayvan daha sonra bu koku ve toplam keşif süresi 3 dakika içinde tek bir seyreltme kaydedilir inceler. Kokusu birden fazla dilüsyonları farklı, saf konularda test edilir ve toplam keşif farelerin her grup için doz yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Iki araştırmacı bir konu genotipler ve / veya durum kör test yer almalıdır. İlköğretim araştırmacı <ol><li> Dört temiz kafeslerde (8 inç cinsinden H x 10 W x 18 L), tüm yataklar olmadan alın. Biyogüvenlik kabini dört kafesleri hizaya getirin. </li><li> Opak filtre kağıdı kullanarak her arenada arasındaki bölümleri ayarlayın. Final bölüm boyunca siyah bir poster koyun gibi siyah yan çizgiler yan ve alt kafesin. Pleksiglas açık bir parça ışık arenada aydınlatmak için izin arena üst kapağı. (A) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="Şekil 1" /> (B) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="Şekil 1.5" /> Şekil 1. Arena Set-Up (a) Düzgün bol dökümlü, boş bir arenada (b) Arena konu ve kokulu filtre kağıdı . </li> <li> Konularda habituating başlayın. Ilk konu için ilk alışma kafesine yerleştirin. 15 dakika sonra, ikinci kafesine ilk konu taşıyın. Quatricide TB ilk kafes temizleyin. Sonra, ilk temizlenir, kafes içinde ikinci konu yerleştirin. Sonraki konular ile bu işleme devam edin. Sonuçta, her konu, her üç test alışkanlık önce bir 15 dakika için arenada (dördüncü ve son kafes) sunulmadan önce kafeslerde alışmış olmalıdır. </li></ol> Kör araştırmacı <ol><li> 2 inç uygun bir numarası koku örnekleri için filtre kağıdı 2 inç kare olun. </li><li> Önceden seçilmiş bir koku kullanarak, uygun şekilde seyreltilmiş. Fıstık ezmesi gibi hidrofobik örnekleri için, çözücü olarak yağ kullanmak; tüm diğerleri için, distile su kullanın. Vorteks. </li><li> Tüm kafes sonuna odak olduğunu biyogüvenlik kabini ucunda bir dijital video kayıt cihazı olarak ayarlayın. Parametreler yeterli olduğundan emin olmak için bir ön video çekin. </li><li> Dilüsyonları, test çalışmaların amacıyla rastgele özen olacağı sipariş kaydedin. </li><li> Kayıt konu çöp ve kimlik numaraları. </li><li> Sonra konu, ilk deneme için hazırlık başlar, 15 dakika arenada alışmış olmuştur. Bir filtre kağıdı kare üzerine pipetleme önce konik tüp ilk seyreltme ve aşağı yukarı Pipet. Filtre kağıdı yüzeyi ~ 85% kapalı (çözüm yaklaşık 0.50 ml) en iyi şekilde olmalıdır. Filtre kağıdı aşırı doymuş olmadığından emin olmak için bir kimwipe kullanın. </li><li> Video kayıt başlayın. </li><li> Hayvan mevcut konumunu ucunu kafes filtre kağıdı kare yerleştirin. </li><li> Zamanlama başlayın. </li><li> 3 dakika sonra, kayıt, durdurma ve seyreltilmiş kokusunu çıkarmak. </li><li> Sadece bir koku (örn. tarçın) test edilecek ise, ilk test konu arena çıkarın. Tekrar, her konu için uygun bir koku seyreltilmesi, her bir hayvan için 6-11 adımları. Birden fazla koku test edilecek ise, ancak, arenada test konu kaldırmak yoktur. Bunun yerine, zamanlama başlar. </li><li> Uygun yukarıda listelenen aynı yöntemleri kullanarak bir sonraki kokusu sulandırmak. </li><li> 1 dakika sonra, video kayıt başlar. Hayvan mevcut positio ucunu kafes bir sonraki kokusu seyreltme ile filtre kağıdı kare yerleştirin.n. </li><li> Tekrar, her deneme için video dosya numarasını belirterek, her koku için 6-13 adımları. </li><li> Tekrar her konu için 6-14 adımları. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Koku alma hassasiyeti test bir oturum Temsilcisi sonuçlar kontrol grubu (Grup A) ya da deney grubu (Grup B) Her bir fare tarçın beş farklı dilüsyonları biri üç dakikalık seans için filtre kağıdı ayıklamak birine maruz kalmıştır . Toplam süre filtre kağıdı değerlendirildi keşfetmek geçirdi. Grup Fare Grup B&#39;de daha büyük bir koku alma hassasiyeti </li></ol> Olfaktör Tercihi Test Bu test, yani belirli algılama eksiklikleri, çekici ya da caydırıcı kokular anlamda yeteneği belirlemek için tasarlanmıştır. Aşağıdaki yordamı Kobayakawa, protokol, K., ve ark. Al.3 bolca ödünç alır. Yine, iki araştırmacı bir konu genotipler ve / veya durum kör, test dahil edilmelidir. Toplam keşif süre sonra tekrar çeşitli kokular (video izleme üzerine) kaydedilir. Bu kokular toplam keşif kat daha fazla sudan daha az su çok kez bu &quot;caydırıcı&quot; denir, &quot;çekici&quot; olarak belirlenmiş. Araştırmacı sonra aynı kokuları farklı denekler için &quot;çekici&quot; veya &quot;caydırıcı&quot; olmadığını düşünmektedir. Koku Hassasiyet Test Bölümü birincil araştırmacı 1-3 adımları takip edin. Kör Araştırmacı Koku tercih test prosedürü, 2 ve 4. adımları hafif değişiklikler ile aynıdır. Aşağıdaki değişiklikleri, kör bir araştırmacı için Koku Hassasiyet Test Bölümü 1-15 adımları takip edin: 2. adım için, önceden seçilmiş kokular (hem çekici ve caydırıcı kokular bir kombinasyonu) kullanılarak, her uygun sulandırılmış çözümler konik tüpler. Fıstık ezmesi gibi hidrofobik örnekleri için, çözücü olarak yağ kullanmak; tüm diğerleri için, distile su kullanın. Vorteks. Adım 4 için, test edilmesi seyreltme kayıt yerine, çalışmaların amacıyla rastgele, çeşitli kokular test edilecektir sırasını kaydeder. Bu test, yani belirli algılama eksiklikleri, çekici ya da caydırıcı kokular anlamda yeteneği belirlemek için tasarlanmıştır. Aşağıdaki yordam Kobayakawa, K. ve ark protokol bolca ödünç 3. Yine, iki araştırmacı bir konu genotipler ve / veya durum kör, test dahil edilmelidir. Toplam keşif süre sonra tekrar çeşitli kokular (video izleme üzerine) kaydedilir. Toplam keşif kat daha fazla sudan daha az su çok kez bu &quot;caydırıcı&quot; denir bu kokular, &quot;çekici&quot; olarak belirlenmiş. Araştırmacı sonra aynı kokuları farklı denekler için &quot;çekici&quot; veya &quot;caydırıcı&quot; olmadığını düşünmektedir. Koku Hassasiyet Test Bölümü birincil araştırmacı 1-3 adımları takip edin. Kör Araştırmacı Koku tercih test prosedürü, 2, 4 ve 13. adımları hafif değişiklikler ile aynıdır. Aşağıdaki değişiklikleri, kör bir araştırmacı için Koku Hassasiyet Test Bölümü 1-15 adımları takip edin: 2. adım için, önceden seçilmiş kokular (hem çekici ve caydırıcı kokular bir kombinasyonu) kullanılarak, her uygun sulandırılmış çözümler konik tüpler. Fıstık ezmesi gibi hidrofobik örnekleri için, çözücü olarak yağ kullanmak; tüm diğerleri için, distile su kullanın. Vorteks. 4. adımı, test edilmesi seyreltme kayıt yerine, her deneme amacıyla rastgele, test edilecek çeşitli kokular sırasını kaydeder. 13 adım için, hayvan mevcut konumunu ucunu kafes sonraki kokusu ile filtre kağıdı kare yerleştirin. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Koku alma tercih test oturumu için Temsilcisi Her fare filtre kağıdı üzerinde farklı kokular her biri üç dakikalık seans için maruz oldu. Toplam süre filtre kağıdı değerlendirildi keşfetmek geçirdi. Fıstık ezmesi ve vanilya çekici kokular (keşif zaman kokusu&gt; keşif zaman su) ve 2-Methylbutyric Asit (keşif zaman kokusu &lt;keşif zaman su) caydırıcı. Koku testleri Puanlama Koku hassasiyeti ve tercih videoları oturduktan sonra, her seyreltme / koku keşfetmek harcanan toplam süre analiz etmek gereklidir. Kör araştırmacı tutarlılığı için tüm videoları analiz var. <ol><li> Vid önizlemeeo, aşağıdaki not: fare filtre kağıdı inceler ve d) üç dakika geçtikten a), filtre kağıdı arenada yerleştirilir, b) fare filtre kağıdı, c yaklaştığında) (filtre kağıt) arenada yerleştirildi. Fare davranış odaklanmak zaman bilmek, doğru bir inceleme sonucunda keşfetmek harcanan toplam süre daha kolay puan yapar. </li><li> Video gözden geçirin. Fareyi ilk filtre kağıdı (gecikme) inceler zaman unutmayın. </li><li> Tüm araştırmalar arenada filtre kağıdı yerleştirerek üç dakika içinde bir kronometre, zaman kullanma. Soruşturma zaman fare burun filtre kağıdı &lt;1 mm herhangi bir zaman olarak tanımlanır. Fare filtre kağıdı yakın zaman önemlidir, ama aktif olarak soruşturma değil. Toplam keşif zaman kağıt üzerinde oturan kağıt veya nöbetleri çiğneme ve yalama nöbetleri dahil etmeyin. Koku alma davranışını doğru analiz etmek için yakından ve sürekli olarak bu kurallara uymak için gereklidir. </li><li> Kayıt gecikme süresi, toplam süre filtre kağıdı ve video dosya numarası soruşturma geçirdi. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

Söz konusu testler hızlı ve güvenilir bir temel koku fonksiyonunun değerlendirilmesi için izin verir. Bu güvenilirliğini test etmek için kişilerin doğru seçimi ve hazırlık gerektirir, ancak göz ardı edilecek değildir. Hasta ya da başka sakat hayvanların çoğu zaman tutarsız denekler. Ayrıca, denekler alışkanlık anahtarı. Alışma süreci sırasında, birden fazla kafesleri kullanımı, hayvanların deneyci işleme ve çevresi değişen rahat olmak için izin verdiğini bulduk. Ayrıca alışkan...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

Kemirgen koku alma sistemi, sistem biyolojisi, basmakalıp, ama ulaşılabilir bir devre nedeniyle kısmen çalışılan bilim adamları, giderek daha çok ilgisini çekmektedir. Buna ek olarak, bir organizmanın hayatı boyunca yeni nöronlar oluşturmak için bu alanda benzersiz yeteneği hem gelişimsel ve rejeneratif biyologlar için cazip bir sistem haline getirmektedir. Bu ilgi, koku alma fonksiyonu hızlı, güvenilir bir değerlendirme için bir araç gerektirir. Koku alma yeteneği çoğu testlerin fareler için özel olarak tasarlanmış karmaşık, değişken ya da değil. Ayrıca, bazı testler bellek kusuru yanı sıra koku alma yetenekleri, karıştırıcı elde edilen sonuçlar hatalarına karşı duyarlı. Burada koku alma hassasiyeti ve tercih kusurları belirlemek için tasarlanmış basit bir pil testleri açıklar. Birincisi, ilk genel sağlık değerlendirmesi daha fazla test için uygun hayvanların tanımlanması için sağlar. İkincisi, fareler, bir eşik farkı olup olmadığını tespit etmek için çeşitli kokular dilüsyonları maruz kalmaktadır. Üçüncü olarak, fareler koku alma tercih değerlendirilmesi için izin çekici ve caydırıcı hem de çeşitli kokular, sunulmaktadır. Bu basit çalışmalar, çeşitli kaynakları ve uzmanlık laboratuvarları için erişilebilir koku alma davranışları ilk karakterizasyonu yapmak gerekir.

Watch this Scientific Journal Video about Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse at JoVE.com

Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

Kemirgen koku alma sisteminin temel karşın benzersiz özellikleri biyologlar arasında artan çalışmaya yol açmıştır. Işlevi nispeten basit bir değerlendirme daha sonra da ihtiyaç vardır. Burada fare koku alma hassasiyeti ve tercih karakterizasyonu için hassas testler açıklar.

Yetişkin Fare Olfaktör Davranış Testi

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Görüntüleme.  Dana Farber Cancer Institute. Kemirgen koku alma sisteminin temel karşın benzersiz özellikleri biyologlar arasında artan çalışmaya yol açmıştır. Işlevi nispeten basit bir değerlendirme daha sonra da ihtiyaç vardır. Burada fare koku alma hassasiyeti ve tercih karakterizasyonu için hassas testler açıklar.

Video: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Biyoloji

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Submukoza ve Lamina Propria yetişkin fare enterik gliyal hücrelerini izolasyon

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...